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人白細(xì)胞介素 1β 檢測指南
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人白細(xì)胞介素 1β 檢測指南 實驗前，抗人白細(xì)胞介素 1β 抗體早已在微孔酶標(biāo)板這個 “秘密基地” 布下 “天羅地網(wǎng)”。當(dāng)加入 IL-1β 校準(zhǔn)品和待測樣本時，IL-1β 就像 “小目標(biāo)”，主動與抗體結(jié)合。緊接著，HRP 標(biāo)記的抗人白細(xì)胞介素 1β 抗體也來 “湊趣”，三者形成穩(wěn)固的 “夾心復(fù)合物”。經(jīng)過一番溫育和充分洗滌，去除未結(jié)合的雜質(zhì)后，加入底物 A 和 B，在 HRP 這位 “魔法師” 的催化下，底物從無色變?yōu)樗{(lán)色，再加入終止液（2M 硫酸），瞬間變成黃色。神奇的是，黃色的深淺與 IL-1β 的濃度成正比。最后，通過酶標(biāo)儀在 450nm 波長下測定吸光度（OD 值），就能計算出樣本中 IL-1β 的濃度。 實驗前的準(zhǔn)備工作至關(guān)重要。要提前 2 小時將試劑盒和樣本從冰箱中取出，讓它們在室溫下 “蘇醒”。從冰箱拿出的濃縮洗滌液若有結(jié)晶，別擔(dān)心，這是正常現(xiàn)象，放在溫水里泡一泡，結(jié)晶就會融化，然后按 1:20 的比例用蒸餾水稀釋。底物液 A 和 B 需在使用前按 1:1 的體積混合，并且要在 15 分鐘內(nèi)使用，否則就會 “罷工”。 實驗還需要一些 “小伙伴” 的助力，包括酶標(biāo)儀（450nm）、精密移液器及一次性吸頭、蒸餾水、洗瓶或自動洗板機、37℃水浴鍋或恒溫箱、500ml 量筒。 樣本采集后，細(xì)胞培養(yǎng)上清、血清、血漿都要在 4000rpm 的轉(zhuǎn)速下離心 20 分鐘，上清液存放在 - 20℃以下，避免反復(fù)凍融。組織勻漿需用預(yù)冷的 PBS 沖洗、剪碎后按 1:9 的比例與 PBS 混合研磨，還可超聲破碎或反復(fù)凍融，5000×g 離心 5 - 10 分鐘取上清。細(xì)胞提取液的獲取，貼壁細(xì)胞經(jīng) PBS 清洗、胰蛋白酶消化后離心收集，懸浮細(xì)胞直接離心收集，細(xì)胞用 PBS 洗滌 3 次，重懸后反復(fù)凍融，1500×g 離心 10 分鐘取上清。其他生物體液則在 1000×g 離心 20 分鐘后取上清檢測。 操作時，先配制好工作液，從鋁箔袋中取出所需板條，剩余的密封放回冰箱。設(shè)置好標(biāo)準(zhǔn)品孔、0 值孔、空白孔和樣本孔，加入相應(yīng)液體后，加入 HRP 標(biāo)記的檢測抗體，用封板膜蓋住反應(yīng)板，在 37℃避光孵育 60 分鐘。接著進(jìn)行洗板，若用自動洗板機，別忘了添加 30 秒浸泡步驟。將底物混合后加入各孔，再次避光孵育 15 分鐘，最后加入終止液，在酶標(biāo)儀 450nm 波長上讀取 OD 值。 以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，對應(yīng)的吸光度為縱坐標(biāo)，用計算機軟件擬合創(chuàng)建標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，通過樣本吸光度計算濃度值，若樣本被稀釋，需乘以稀釋倍數(shù)。 |
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