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| 【懸賞金幣】回答本帖問(wèn)題，作者飛魚沖沖沖將贈(zèng)送您 5 個(gè)金幣 | ||
飛魚沖沖沖新蟲 (初入文壇)
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[求助]
有做鏈霉菌接合轉(zhuǎn)移的前輩和友友嗎，求助�。�
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大家好，最近在做鏈霉菌接合轉(zhuǎn)移條件摸索，由于實(shí)驗(yàn)室沒(méi)人做這個(gè)，從開始到現(xiàn)在已經(jīng)快2個(gè)月了，自己獨(dú)自摸索遇到了一些問(wèn)題想要請(qǐng)教一下。 ①孢子懸液大家一般用的是第一代（也就是鏈霉菌在板子上完全變灰產(chǎn)孢后，加入無(wú)菌水，用槍頭刮取孢子懸浮進(jìn)行制備），還是用的待第一代制備的孢子懸液再次涂布，待其產(chǎn)孢后再進(jìn)行制備的第二代或者第三代） ②大家選取質(zhì)粒和供體菌時(shí)一般怎么選取的，有什么依據(jù)或者有什么考慮，通過(guò)查閱文獻(xiàn)我用的是pSET152質(zhì)粒和PUZ8002大腸桿菌，不知道能不能行得通，也有在文獻(xiàn)中看到自己構(gòu)建載體的。 ③大家進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的孢子懸液濃度是怎么設(shè)置的，有進(jìn)行稀釋嗎，稀釋倍數(shù)是怎樣的。我看文獻(xiàn)有的說(shuō)是用10的-8次方，想知道大家一般怎么來(lái)測(cè)定孢子懸液的濃度，是通過(guò)血球板記數(shù)法嗎，我前期用這個(gè)方法放顯微鏡下想進(jìn)行計(jì)數(shù)來(lái)著，發(fā)現(xiàn)視野下很難觀察，首先是不知道哪個(gè)是我的孢子，其次里面還有很多菌絲和長(zhǎng)條的東西，觀察起來(lái)很困難。 ④鏈霉菌孢子萌發(fā)是否為接合轉(zhuǎn)移的前提，還是促進(jìn)其萌發(fā)。因?yàn)楹笃跍?zhǔn)備篩一下鏈霉菌孢子預(yù)萌發(fā)條件，查文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)有的篩了孢子預(yù)萌發(fā)條件，有的沒(méi)有，也有文章沒(méi)有用鏈霉菌孢子做接合轉(zhuǎn)移，而是用的菌體，這是否說(shuō)明孢子萌發(fā)并不是鏈霉菌接合轉(zhuǎn)移成功的前提，只是一個(gè)會(huì)促進(jìn)其接合轉(zhuǎn)移的因素。 ⑤篩選孢子預(yù)萌發(fā)條件，包括它的預(yù)萌發(fā)液體培養(yǎng)基、時(shí)間，根據(jù)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)詳細(xì)寫這一步過(guò)程的，提到是將孢子懸液熱激后打入適量到不同的液體培養(yǎng)基中再搖床培養(yǎng)，每隔30分鐘放在顯微鏡進(jìn)行觀察，觀察比較它們的萌發(fā)情況。誰(shuí)萌發(fā)的快，誰(shuí)就更好。 可是我將我的孢子懸液案照這個(gè)步驟進(jìn)行的時(shí)候發(fā)現(xiàn)，通過(guò)觀察孢子懸液，我發(fā)現(xiàn)顯微鏡視野下很多長(zhǎng)條，菌絲，不太清楚哪一個(gè)才是鏈霉菌孢子，我有通過(guò)將孢子懸液多過(guò)濾幾次，希望充分將孢子懸液中的菌絲雜質(zhì)除去，結(jié)果發(fā)現(xiàn)再次觀察的時(shí)候還是存在這種情況，后期準(zhǔn)備先用一種液體培養(yǎng)基培養(yǎng)孢子懸液，每隔一段時(shí)間在顯微鏡下觀察鏈霉菌萌發(fā)情況，了解它的萌發(fā)形態(tài)。不知道能不能行得通。不知道做過(guò)這一步的前輩，大家的鏈霉菌孢子都是啥樣的，都怎么來(lái)做的預(yù)萌發(fā)條件篩選，有沒(méi)有什么建議能否提供。 ⑥還有就是熱激溫度和熱激時(shí)間的篩選。查文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)有的是直接把轉(zhuǎn)進(jìn)質(zhì)粒的供體菌和受體菌放在一塊兒培養(yǎng)一段時(shí)間，觀察不同溫度時(shí)間下的接合子生長(zhǎng)情況數(shù)量來(lái)進(jìn)行篩選。有的是通過(guò)顯微鏡觀察不同熱激溫度和熱激時(shí)間下孢子的萌發(fā)情況來(lái)進(jìn)行比較。自我感覺(jué)兩種方法有利有弊，前者等接合子長(zhǎng)出來(lái)這段時(shí)間比較長(zhǎng)，但更直觀，后者一天之內(nèi)就能知道，但是顯微鏡觀察存在很多主觀性，觀察也不太好觀察。想知道前輩們是怎么來(lái)做這一步的，有沒(méi)有好的建議。 ⑦最后就是對(duì)這方面比較了解或者做成功的前輩或者友友，有沒(méi)有protocal，可否方便提供一下，如果可以，不勝感激�。�！@天使托 |
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