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承接實(shí)驗(yàn)外包鐵蟲(chóng) (初入文壇)
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[交流]
“抗體表面展示的細(xì)胞外囊泡用于靶向癌癥治療”
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今天為大家分享一篇2024年發(fā)表在Nature Biomedical Engineering的文章，題目為“Antibody-displaying extracellular vesicles for targeted cancer therapy”。本文中，作者開(kāi)發(fā)了一種模塊化的細(xì)胞外囊泡（EVs）系統(tǒng)（Fc-EVs），能夠通過(guò)特定的Fc結(jié)合域與不同類型的IgG抗體結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)幾乎任何組織的靶向，并在構(gòu)建藥物遞送系統(tǒng)用于腫瘤的精準(zhǔn)治療中具有巨大潛力。 圖片 01背景介紹 程序性細(xì)胞死亡蛋白1（PD-1）及其配體PD-L1是免疫療法中的主要靶點(diǎn)之一，盡管PD-L1在多種惡性腫瘤中高度表達(dá)，但只有部分患者對(duì)治療有持久反應(yīng)。為了提高反應(yīng)率，治療策略包括聯(lián)合化療、多重檢查點(diǎn)抑制和其他免疫刺激方法。然而，這些策略在將不同治療方法協(xié)調(diào)遞送到目標(biāo)部位時(shí)存在局限性。EVs是一種直徑范圍從30 nm到2000 nm且具有異質(zhì)性的天然納米囊泡。EVs含有來(lái)自親本細(xì)胞的脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸，并且具有通過(guò)細(xì)胞間通信系統(tǒng)傳遞這些大分子的獨(dú)特能力，可以影響鄰近細(xì)胞或遠(yuǎn)處細(xì)胞。因此，利用EVs構(gòu)建靶向癌癥治療的模塊化遞送系統(tǒng)具有廣闊前景。 02設(shè)計(jì)思路 該研究利用分子工程工具，開(kāi)發(fā)了能夠結(jié)合抗體片段可結(jié)晶區(qū)（Fc）的EVs，使得可變區(qū)能夠展示以識(shí)別抗原。這種Fc結(jié)合的EVs（Fc-EVs）可以修飾不同類型的抗體，從而靶向幾乎任何感興趣的組織。 圖片 圖1 原理圖 03數(shù)據(jù)介紹 （1）Fc-EVs的優(yōu)化 為了優(yōu)化Fc-EVs的展示效率和靶向能力，作者篩選了不同的Fc結(jié)合域和EVs分選域。作者首先對(duì)9個(gè)在C端或N端與報(bào)告蛋白mNG融合的EV分選結(jié)構(gòu)域進(jìn)行評(píng)估（圖2a）,通過(guò)成像流式細(xì)胞術(shù)（IFC）結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)當(dāng)mNG與四次跨膜蛋白(CD9、CD63、CD81)、膜聯(lián)蛋白V或腫瘤壞死因子受體(TNFR)融合時(shí)，細(xì)胞表現(xiàn)出最高的表達(dá)水平(圖2b)，而其他EVs分選域的mNG水平較低。接著，通過(guò)比較表達(dá)9種不同EV分選結(jié)構(gòu)域的不同EV生成細(xì)胞的條件培養(yǎng)基，TNFR和四跨蛋白，特別是C端融合的CD63，每毫升mNG陽(yáng)性(mNG+)數(shù)勝過(guò)其他EVs分選結(jié)構(gòu)域 (圖2c) 。通過(guò)與四次跨膜蛋白或TNFR融合，EVs被設(shè)計(jì)成顯示蛋白A、z或4z結(jié)構(gòu)域。所有構(gòu)建體都產(chǎn)生了帶有Fc結(jié)合物的工程化EVs，CD63-z的結(jié)合產(chǎn)生了最高水平的表達(dá)(圖2d)。所有EV都顯示出抗體結(jié)合能力，當(dāng)使用z結(jié)構(gòu)域時(shí)，四次跨膜蛋白構(gòu)建體之間的結(jié)合效率相似，但使用TNFR作為表達(dá)支架時(shí)，其結(jié)合效率明顯較低(圖2d)。當(dāng)使用4z或蛋白A作為Fc結(jié)合劑時(shí)，也觀察到類似的趨勢(shì)。此外，CD63-z融合也產(chǎn)生了最高表達(dá)水平的工程化EVs(圖2e)，因此，作者最終確定了CD63與z域融合產(chǎn)生的EVs作為最佳的Fc-EVs候選者，展現(xiàn)出最高的表達(dá)水平和Fc結(jié)合能力。 圖片 圖2 EV分選蛋白和Fc結(jié)合域的篩選 （2）Fc-EV的表征 作者使用多種方法詳細(xì)表征了Fc-EVs的物理特性和功能性。首先，作者采用納米顆粒跟蹤分析（NTA）技術(shù)進(jìn)行分析，結(jié)果表明Fc-EVs具有大約100 nm的峰徑（圖3a）。為了進(jìn)一步確認(rèn)抗體與Fc-EVs的結(jié)合，作者用尺寸排阻色譜（SEC）（圖3b，e）、IFC（圖3c）、納米成像（圖3f）證明了Fc-EVs與抗體的有效結(jié)合。接著，作者同時(shí)評(píng)估了不同IgG亞型對(duì)Fc-EVs的親和力（圖3d），其中人IgG1（hIgG1）對(duì) Fc-EVs的親和力最大，這與之前關(guān)于蛋白質(zhì) A 和 z 結(jié)構(gòu)域的報(bào)道結(jié)果一致。最后，作者使用單顆粒分析儀（SPP）對(duì)單個(gè)EV上抗體的定量分析（圖3g、h、i）。綜上，證實(shí)了抗體能夠高效且穩(wěn)定地結(jié)合在Fc-EVs上。 圖片 圖3 Fc-EVs的表征 （3）抗體修飾的Fc-EVs的多功能靶向性 為了證明所開(kāi)發(fā)的Fc-EVs技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的高效靶向，作者使用特定的腫瘤細(xì)胞系：HER2陽(yáng)性的乳腺癌細(xì)胞和PD-L1陽(yáng)性的黑色素瘤細(xì)胞，在體外驗(yàn)證修飾相應(yīng)抗體后Fc-EVs的靶向能力。與未修飾的EV相比，在臨床使用的 HER2 抗體曲妥珠單抗的引導(dǎo)下Fc-EVs能被HER2 陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞（SKBR-3 細(xì)胞）顯著攝取（圖4a）。在PD-L1表達(dá)的惡性黑色素瘤細(xì)胞（B16F10）系中也得到了相似的結(jié)論，在阿替利珠單抗的引導(dǎo)下，F(xiàn)c-EVs 能被B16F10細(xì)胞顯著攝取（圖4b）。熒光顯微鏡成像結(jié)果（圖4c）進(jìn)一步證實(shí)了抗體修飾后能夠顯著提高腫瘤細(xì)胞對(duì)EVs的攝取。 圖片 圖4 使用抗體進(jìn)行Fc-EV靶向 （4）抗體修飾的Fc-EVs靶向腫瘤 作者通過(guò)PD-L1抗體修飾的Fc-EVs在惡性黑色素瘤（B16F10）荷瘤小鼠模型中的表現(xiàn)反映抗體修飾后Fc-EVs的腫瘤靶向能力（圖5a）。與單獨(dú)使用 Fc-EVs相比，PD-L1-Ab的修飾顯著增加了 Fc-EVs 在腫瘤組織中的積累，而同種對(duì)照不影響Fc-EVs在腫瘤中的積累（圖5b），用Fc-EVs+ PD-L1-Ab處理的小鼠，在注射后30分鐘腫瘤積累達(dá)到最高水平（圖5c）。作者也評(píng)估了Fc-EVs在血漿中的半衰期，與先前的調(diào)查結(jié)果一致，F(xiàn)c-EVs在血漿中的半衰期為3-4分鐘，與單獨(dú)使用Fc-EVs或顯示PD-L1-Ab或IgG-ctrl時(shí)沒(méi)有顯著差異（圖5d），與Fc-EVs+ IgG-ctrl 相比，F(xiàn)c-EVs+ PD-L1-Ab 在脾臟和肝臟中檢測(cè)到的 EV 水平略低（圖5e，f），組織分布的差異進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了該方法的靶向效率。接著，作者在對(duì)小鼠注射mNG Fc-EVs后使用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)來(lái)自分離組織中的單細(xì)胞懸液進(jìn)行熒光檢測(cè)。與對(duì)照抗體相比，當(dāng)顯示PD-L1-Ab時(shí)，F(xiàn)c-EVs在腫瘤細(xì)胞中富集，特別是在PD-L1腫瘤細(xì)胞中（圖5g，h），同時(shí)，F(xiàn)c-EVs同樣能在腫瘤組織的T細(xì)胞中積累（圖5i）。 圖片 圖5 使用PD-L1抗體修飾Fc-EV靶向腫瘤 接下來(lái)，為了評(píng)估Fc-EVs在腫瘤靶向中的通用性，作者將其應(yīng)用于HER2陽(yáng)性乳腺癌模型（圖6a）。與前述PD-L1陽(yáng)性惡性黑色素瘤模型類似，展示HER2抗體的Fc-EVs能夠特異性地積累在HER2陽(yáng)性的乳腺癌腫瘤組織中（圖6b-d）。圖片 圖6 使用HER2抗體修飾Fc-EV靶向腫瘤 （5）PD-L1抗體修飾的Fc-EVs用于惡性黑色素瘤的治療 基于前述抗體修飾的Fc-EVs對(duì)腫瘤的靶向性，作者進(jìn)一步探究了Fc-EVs是否可以用作靶向遞送化療藥物的遞送載體。作者每三天用負(fù)載Dox并用PD-L1-Ab修飾的Fc-EVs對(duì)攜帶B16F10的黑色素瘤小鼠進(jìn)行全身治療（圖7a）。與對(duì)照組相比，F(xiàn)c-EVs + Dox + PD-L1-Ab顯著抑制了腫瘤進(jìn)展，腫瘤生長(zhǎng)尺寸減小并顯著提高生存率（圖7b-d）。為了評(píng)估該方法在長(zhǎng)時(shí)間治療中的有效性，作者將終點(diǎn)設(shè)置為35天，進(jìn)行了第二次實(shí)驗(yàn)（圖7e），如預(yù)期的那樣，F(xiàn)c-EVs+ Dox + PD-L1-Ab治療再次顯示出隨著時(shí)間的推移腫瘤大小發(fā)展減少（圖7f，g）和顯著提高的生存率（圖7h）。 圖片 圖7 PD-L1抗體修飾的Fc-EVs用于惡性黑色素瘤的治療 04總結(jié) 作者開(kāi)發(fā)了一種EV-抗體聯(lián)合療法，通過(guò)在Fc-EVs上展示特定的抗體，實(shí)現(xiàn)了對(duì)腫瘤細(xì)胞的精確靶向，并且Fc-EVs可以作為藥物遞送系統(tǒng)，通過(guò)將化療藥物Dox封裝于EVs中，能夠提高藥物的療效并減少副作用。 |
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