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huangyan.88.新蟲 (小有名氣)
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[交流]
常見的BCA法檢測蛋白定量
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在蛋白質(zhì)比色定量試驗(yàn)中，最常用的方法是二喹啉甲酸（Bicinchoninic acid，BCA）法蛋白定量。那么為什么我們要選擇用BCA法？BCA法是Lowry測定法的一種改進(jìn)方法，與Lowery法相比，BCA蛋白測定方法操作更簡單，試劑及其形成的顏色復(fù)合物穩(wěn)定性更好，幾乎沒有干擾物質(zhì)的影響，靈敏度高（微量檢測可達(dá)到0.5μg/ml），應(yīng)用更加靈活。與Bradford法相比，BCA法的顯著優(yōu)點(diǎn)是不受去垢劑的影響。 BCA法蛋白定量的原理是什么？ 大多數(shù)蛋白樣品可通過比色測定法定量，在典型的蛋白測定中，化學(xué)試劑加入到蛋白樣品溶液里產(chǎn)生顏色變化，這一變化可由分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀檢測，并與已知濃度的蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線作比較。BCA法是在堿性環(huán)境下蛋白質(zhì)與Cu2+絡(luò)合并將Cu2+還原成Cu1+，BCA與Cu1+結(jié)合形成穩(wěn)定的紫藍(lán)色復(fù)合物，在562 nM處有高的光吸收值并與蛋白質(zhì)濃度成正比，據(jù)此可測定蛋白質(zhì)濃度。 BCA法蛋白定量是如何操作的？ 1 先將solution A 搖晃混勻，根據(jù)樣品數(shù)量，按50體積solution A加1體積solution B試劑（50:1）配制成BCA工作液，充分混勻。BCA工作液在24小時內(nèi)穩(wěn)定。 2 稀釋標(biāo)準(zhǔn)品：蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品（5mg/ml BSA，-20℃保存）用生理鹽水或PBS稀釋成2000ug/ml，1000 ug/ml，500 ug/ml，250 ug/ml，125 ug/ml，62.5 ug/ml，31.25 ug/ml，15.625 ug/ml八個濃度的蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液。（大家根據(jù)實(shí)驗(yàn)室的標(biāo)準(zhǔn)品的濃度合理設(shè)計(jì)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的濃度） 3 樣本的制備：蛋白質(zhì)樣品用細(xì)胞總蛋白提取試劑提取總蛋白。 4 取步驟2中的20ul蛋白標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品至96孔板中。 5 在各孔中加入200微升BCA工作液，這時使用加樣槍輕柔吹打，將其中液體混勻，這時請注意，盡量小一點(diǎn)力氣輕柔一點(diǎn)，不要弄出很多氣泡，這樣會影響讀數(shù)，然后再37℃室內(nèi)放置30-60min。將液體冷卻至室溫，在酶標(biāo)儀上測定562nm（或540-590nm之間）的波長的吸光值，最后可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出蛋白質(zhì)的濃度，為樣品蛋白質(zhì)定量。 濃度計(jì)算步驟 1 輸入相對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線值和相應(yīng)的蛋白樣品值，一般是8個點(diǎn)。 2 然后將上面數(shù)據(jù)做圖表（XY 散點(diǎn)圖），點(diǎn)擊圖表里面的散點(diǎn)，右鍵添加趨勢曲線。 3 然后彈出設(shè)置趨勢線格式，點(diǎn)擊選勾最底下顯示公式（E）以及顯示R平方值。則在圖表標(biāo)題中顯示出公式和R2值來。一般 R2值越接近1代表你的標(biāo)準(zhǔn)曲線做得越好，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線帶入的樣品OD值測出的蛋白濃度也越準(zhǔn)確。R2值越接近1越好，一般要求為0.99幾左右。 4 將樣品OD值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線的公式中，即得到待測樣品蛋白的濃度。 |
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