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用于傷口愈合的納米結(jié)構(gòu)生物活性絲素支架
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【摘要】 全層傷口的無疤痕皮膚再生仍是皮膚組織工程中的一個(gè)挑戰(zhàn)。在這里，通過模仿細(xì)胞外基質(zhì)的化學(xué)成分和生物物理納米結(jié)構(gòu)，設(shè)計(jì)了一種新型的生物活性支架。通過引入透明質(zhì)酸(HA)和天然絲素納米纖維(snf)，通過凍干法制備了具有較高孔隙率(~92.5%)、吸水率(~96%)和溶脹率(~90%)的絲素SF基支架。在體外，將人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)植入納米結(jié)構(gòu)的支架中。結(jié)果顯示，支架具有更好的細(xì)胞相容性，支持細(xì)胞擴(kuò)散、增殖和分化。在體內(nèi)，支架對裸鼠全層皮膚缺損的影響表明，snf摻入支架不僅可以加速傷口愈合(4周內(nèi)，高達(dá)98.2 ±0.5%)同時(shí)，納米纖維作為模板可以調(diào)節(jié)膠原排列，抑制瘢痕形成。本研究為探索具有生物活性的天然snf支架材料用于新型創(chuàng)面敷料和人工皮膚提供了有益的策略。該文章發(fā)表在《Composites Part B: Engineering》上。 【一、樣品制備和表征】 作者將HA溶解于SF溶液中，在溶液中加入NHS和EDC加鏈接，凍干得到SF-HA支架，將SNFs分散于RSF溶液中通過相同操作得到EDC交聯(lián)天然SNFs-RSF溶液(見圖1)。RSF溶液作為粘合劑將天然SNFs粘附在SF-HA支架上。最后，凍干48h獲得SF-HA-SNFs支架。 由下圖可知，SF、SF-HA和SF-HA-SNFs支架的孔隙率分別約為89.1±3.4%、92.5±3.9%和91.8±3.8%。與純SF支架相比，HA的摻入不僅可以增強(qiáng)支架的多親水性官能團(tuán)(-COOH、-NH2和-OH)的水結(jié)合能力，還可以改善支架的力學(xué)性能。此外，納米纖維可以作為增強(qiáng)機(jī)械性能的重要組分也是其典型特征。如圖所示，SF-HA和SF-HA-SNFs支架的斷裂應(yīng)力和斷裂伸長率分別為12±2.4 KPa和34±4.1%，18.1±3.8 KPa和47.2±6.7%。顯然，SF-HA-SNFs支架的力學(xué)性能提高了約50%。 【二、體外細(xì)胞相容性】 采用CCK-8法檢測HUVECs的附著和增殖情況。當(dāng)細(xì)胞接種1 d時(shí)，含有HA的支架中細(xì)胞的OD值高于純SF支架。細(xì)胞的高活力歸因于HA摻入，增加了HUVECs的生長和增殖的親和性。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，細(xì)胞在這些支架上的增殖能力顯著增強(qiáng)(P < 0.05)。7 d后，SF-HA-SNFs支架的OD值遠(yuǎn)高于不含天然SNFs的支架。無序的納米纖維網(wǎng)絡(luò)與ECM結(jié)構(gòu)相似，可以為細(xì)胞增殖提供更有利的微環(huán)境。 通過SEM和共聚焦顯微鏡觀察，證實(shí)了HUVECs在SF-HA-SNFs支架中的增殖和形態(tài)。經(jīng)過1天的培養(yǎng)，純SF支架上的細(xì)胞呈圓形(圖3B)，并聚集在一起。而細(xì)胞在SF-HA-SNFs支架上的擴(kuò)散更好，說明納米纖維為細(xì)胞附著提供了更合適的動(dòng)態(tài)表面。培養(yǎng)7 d后，在SF-HA- snf支架上生長的HUVECs不僅表現(xiàn)出較厚的附著體，而且在SF-HA-SNFs支架上形成了細(xì)胞片和ECM。 【三、體內(nèi)降解和生物相容性】 為了評估不同支架對傷口愈合的能力，在每只小鼠體內(nèi)制造3個(gè)直徑為6 mm的全皮膚缺損，并植入3種支架。未做任何支架處理的缺損作為陰性對照。圖4展示了不同時(shí)間點(diǎn)皮膚創(chuàng)面變化的數(shù)字照片記錄的小鼠模態(tài)缺陷。通過攝影評價(jià)來檢測支架對小鼠傷口愈合的影響(圖4B)。與空白對照組相比，SF-HA-SNFs支架在3周后顯示出加速的愈合過程，顯示出全皮膚修復(fù)的良好前景。傷口愈合過程的定量評估表明，這三種支架在第7天顯著加速了傷口愈合，并在測試期間持續(xù)。2周后，HA摻入支架處理的傷口愈合率達(dá)到70%以上，明顯高于純SF支架(~ 30%)。3周后，SF-HA-SNFs組創(chuàng)面愈合率超過80%，高于其他支架(SF支架44.9±5.8%，SF-HA支架73.8±3.2%，對照組29.2±6.9%)。實(shí)驗(yàn)時(shí)間點(diǎn)(4周)結(jié)束時(shí)，SF組和對照組均有明顯瘢痕形成，納米結(jié)構(gòu)支架創(chuàng)面閉合率(98.2%±0.5%)高于SF-HA組(90.6±0.7%)。同時(shí)，創(chuàng)面圖像重建表明， SF-HA-SNFs支架有抑制瘢痕生長的潛力。 【四、組織學(xué)分析】 H&E和MT染色試驗(yàn)進(jìn)一步分析皮膚創(chuàng)面愈合過程。從H&E染色圖像(圖5)來看，在植入第1周，皮下組織和各種支架之間沒有明顯的分離。支架內(nèi)幾乎沒有血管樣結(jié)構(gòu)的形成。在支架與宿主組織的連接處觀察到輕度炎癥反應(yīng).。第2周，在SF-HA-SNFs支架處理的缺陷部位出現(xiàn)了一些血管新生(箭頭)，這可能是由于HA有效地促進(jìn)了內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和活性，從而形成了血管化的致密組織。宿主細(xì)胞和新生組織幾乎填滿了支架孔。第3周，SF組和SF-HA組也形成了新的微血管。同時(shí)，SF-HA-SNFs組的降解被松散的組織排列所證實(shí)，這可能歸因于強(qiáng)大的SNFs納米模板為細(xì)胞生長提供了穩(wěn)定的活性位點(diǎn)。 隨著時(shí)間的推移，肉芽組織成熟，毛細(xì)血管密度下降。在重塑階段，所有支架幾乎完全降解，并被再生組織所取代，其中SF-HA- SNFs支架重建的肉芽組織結(jié)構(gòu)與正常皮膚相似。 下圖顯示了膠原纖維沉積在創(chuàng)面愈合過程中的作用。第1周，僅SF組有少量膠原沉積。兩周后，各組膠原沉積均有所增加，但SF組和SF-HA組膠原沉積傾向于沿表皮分布。支架降解明顯(藍(lán)色-實(shí)箭頭)，膠原沉積致密，說明所有創(chuàng)面均處于增殖期。在創(chuàng)面愈合的重塑期(約第4周)，膠原沉積發(fā)生了很大的變化。在SF和SF-HA組中，膠原蛋白仍然粘稠且有取向。相反，SF-HA-SNFs支架組呈連續(xù)沉積，與天然組織高度相似。 【結(jié)論】 通過仿生ECM的化學(xué)和物理結(jié)構(gòu)，成功設(shè)計(jì)了一種新型的生物活性支架。通過引入HA，支架具有優(yōu)異的水結(jié)合力、高孔隙率和良好的力學(xué)性能。此外，利用綠色穩(wěn)定的天然SNFs構(gòu)建類ECM結(jié)構(gòu)支架，體外和體內(nèi)均證實(shí)其具有良好的生物相容性。SF-HA-SNFs支架在細(xì)胞粘附、增殖和加速傷口愈合方面的具有巨大潛力。更重要的是，將SNFs引入絲素蛋白支架具有抑制瘢痕形成的積極作用。因此，這種利用類ECM SF支架的新方法在皮膚組織工程中具有巨大的生物材料設(shè)計(jì)和應(yīng)用前景。 原文鏈接：https://doi.org/10.1021/acspolymersau.3c00050 |
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