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[交流] 科研干貨｜13種蛋白提取方法，趕快收藏手慢無！

單層貼壁細胞總蛋白的提取:

1.倒掉培養(yǎng)液,并將瓶倒扣在吸水紙上使吸水紙吸干培養(yǎng)液(或?qū)⑵恐绷⒎胖靡粫䞍菏箽堄嗯囵B(yǎng)液流到瓶底然后再用移液器將其吸走)。

2.每瓶細胞加3ml 4℃預(yù)冷的PBS(0.01M pH=7.2～7.3)。平放輕輕搖動1min洗滌細胞,然后棄去洗液。重復(fù)以上操作兩次,共洗細胞三次以洗去培養(yǎng)液。將PBS棄凈后把培養(yǎng)瓶置于冰上。

3.按1ml裂解液加10μl PMSF(100mM),搖勻置于冰上。(PMSF要搖勻至無結(jié)晶時才可與裂解液混合。)

4.每瓶細胞加400μl含PMSF的裂解液,于冰上裂解30min,為使細胞充分裂解培養(yǎng)瓶要經(jīng)常來回搖動。

5.裂解完后,用干凈的刮棒將細胞刮于培養(yǎng)瓶的一側(cè)(動作要快),然后用槍將細胞碎片和裂解液移至1.5ml離心管中。(整個操作盡量在冰上進行。)

6.于4℃下12000 rpm離心5min。(提前開離心機預(yù)冷)

7.將離心后的上清分裝轉(zhuǎn)移倒0.5min的離心管中放于-20℃保存。

組織中總蛋白的提取:

1.將少量組織塊置于1～2ml勻漿器中球狀部位,用干凈的剪刀將組織塊盡量剪碎。

2.加400μl單去污劑裂解液裂(含PMSF)于勻漿器中,進行勻漿。然后置于冰上。

3.幾分鐘后再碾一會兒再置于冰上,要重復(fù)碾幾次使組織盡量碾碎。

4.裂解30min后,即可用移液器將裂解液移至1.5ml離心管中,然后在4℃下12000 rpm離心5min,取上清分裝于0.5ml離心管中并置于-20℃保存。

加藥物處理的貼壁細胞總蛋白的提取:

由于受藥物的影響,一些細胞脫落下來,所以除按1)操作外還應(yīng)收集培養(yǎng)液中的細胞。以下是培養(yǎng)液中細胞總蛋白的提取:

1.將培養(yǎng)液倒至15ml離心管中,于2500 rpm離心5min。

2.棄上清,加入4ml PBS并用槍輕輕吹打洗滌,然后2500 rpm離心5min。棄上清后用PBS重復(fù)洗滌一次。

3.用槍洗干上清后,加100μl裂解液(含PMSF)冰上裂解30min,裂解過程中要經(jīng)常彈一彈以使細胞充分裂解。

4.將裂解液與培養(yǎng)瓶中裂解液混在一起4℃、12000 rpm離心5min,取上清分裝于0.5ml離心管中并置于-20℃保存。

Loading Buffer煮細胞抽提總蛋白

1.細胞計數(shù)(約1×106的細胞),離心收集細胞(2000rpm×5min);

2.預(yù)冷1×PBS 500ul重懸洗一次,轉(zhuǎn)至500ul EP管(2000rpm×5min);

3.去上清,后甩一次,將上清去盡;

4.按每1×106的細胞加50ul loading buffer 加入2×loading;

5.Vortex一下,煮10～15min一次×2～3次直至無粘絲;

6.每次煮好將其放于冰上,靜置約2min,Vortex一下,再甩一下;

7.三次后用槍吸起,如沒有粘絲,即可;

8.每次上樣約5ul(50ug/ul蛋白)

RIPA裂解抽提總蛋白

1.細胞計數(shù)(約1×107的細胞),離心收集細胞(2000rpm×5min);

2.預(yù)冷1×PBS 1ml重懸洗2次,轉(zhuǎn)至1.5ml EP管(2000rpm×5min);

3.去上清,后甩一次,將上清去盡;

4.按照如下比例加入裂解試劑:

RIPA:300ul/1×107細胞

PMSF:3ul(1:100)

Cocktail:0.3ul(1:1000)

5.吹打均勻,冰上放置30-40min,中間每10分鐘Vortex一次;

6.4℃預(yù)冷離心:10000rpm ×10min;

7.收集上清,轉(zhuǎn)移至已預(yù)冷新EP管,即為總蛋白。

核,漿蛋白抽提

一.收核-漿蛋白

收漿蛋白

1.細胞計數(shù)(約1.5×107的細胞),離心收集細胞(1100rpm×5min);

2.用4℃預(yù)冷的PBS重懸,轉(zhuǎn)至1.5mL的EP管中,離心(4000rpm×5min,4℃);

3.去上清,加入A Buffer  1mL/1×107 cell,重懸,4℃放置10min,離心(2500rpm×3min,4℃);

4.去上清,加入A’ Buffer 250uL/1.5×107 cell,重懸,4℃放置3min,離心(5000rpm×1min,4℃),吸取上清(上清是漿蛋白);

收核蛋白

5.再用A’ Buffer 500uL/1.5×107 cell,重懸,4℃放置3min,離心(5000rpm×1min,4℃),吸走上清,12000rpm×30sec,把上清完全吸干凈;

6.剩余沉淀中加入B’ Buffer (或者RAPI)50uL,重懸(振蕩),4℃放置40min(每隔10min振蕩一次);

7.離心(12000×10min,4℃),取上清即為核蛋白,-80℃保存。

Buffer A的配制:

終濃度

母液

配40Ml (10ml)溶液所需的量

Hepes PH 7.9

10mM

1M

400uL    (100 ul)

MgCl2

1.5mM

2M

30uL       (7.5 ul)

KCl

10mM

250mM

1.6mL    (400 ul)

DTT

0.5mM

0.1M

200uL    (50 ul)

剩余體積用ddH2O補足至要求體積!

Buffer A’的配制:

Buffer A’(2ml) = 1960ul Buffer A + 40uL 10%NP-40 + 20uL 10mg/mLPMSF + 1uL Aprotinin

Buffer A’(1ml) =  980ul Buffer A + 20uL 10%NP-40 + 10uL 10mg/mLPMSF + 1uL Aprotinin

(Aprotinin可以用cocktail代替,而且只要核蛋白的時候可以不加)

Buffer B 的配制:

終濃度

母液

配40mL(10ml)溶液所需的量

Hepes PH 7.9

20mM

1M

800uL (200 uL)

甘油

25%

50%

20mL    (5 mL)

NaCl

0.42M

3M

5.6mL    ( 1.4 mL)

EDTA

0.2mM

0.5M

16uL    ( 4 uL)

DTT

0.5mM

0.1M

200uL ( 50 uL)

NP-40

0.2%

10%

800uL ( 200 uL)

剩余體積用ddH2O補足至要求體積!

Buffer B’的配制:

Buffer B’ = 1mL Buffer B + 10uL 10mg/mLPMSF + 0.5uL Aprotinin(可以用cockltail代替)

核基質(zhì)蛋白抽提Protocol

1、細胞計數(shù)(約1×107的細胞),離心(1100rpm×5min)收集細胞;

2、用4℃預(yù)冷的PBS重懸,將細胞移至1.5ml EP管中,1×PBS洗一遍;

3、加300ul RIPA/1×107的細胞,裂解細胞,至冰上15-30min;

RIPA+PMSF(1:100)+Cocktail(1:1000)

4、4℃預(yù)冷離心:13000rpm ×10-15min;

5、將離心后的上清轉(zhuǎn)移至新的已4℃預(yù)冷的1.5ml EP管,冰上備用(總蛋白);

6、用1×PBS洗管底的pellet×2遍;

7、加入Urea-Lysis buffer 10-15ul裂解pellets,vortex 10min;

8、4℃預(yù)冷離心:13000rpm ×10min;用BufferA 90ul稀釋,此為核基質(zhì)蛋白。

RIPA(PH 8.0):

150mM NaCL

1% NP-40

0.5% DOC

0.1% SDS

50mM Tris

Urea-Lysis buffer(PH 8.0):

100mM NaH2PO4

10mM Tris-HCL

300mM NaCL

8M urea

Buffer A:

100mM NaH2PO4

10mM Tris-HCL

300mM NaCL

1% Triton X-100

植物組織蛋白質(zhì)提取方法

1、根據(jù)樣品重量(1g 樣品加入3.5ml 提取液,可根據(jù)材料不同適當加入),準

備提取液放在冰上。

2、把樣品放在研缽中用液氮研磨,研磨后加入提取液中在冰上靜置(3-4 小時)。

3、用離心機離心8000rpm40min4℃或11100rpm20min4℃

4、提取上清夜,樣品制備完成。

蛋白質(zhì)提取液:300ml

1、1Mtris-HCl(PH8) 45ml

2、甘油(Glycerol)75ml

3、聚乙烯吡咯烷酮(Polyvinylpolypyrrordone)6g

這種方法針對SDS-PAGE,垂直板電泳!

或者用三氯醋酸—丙酮沉淀法,這種方法針對雙向電泳,雜質(zhì)少,離子濃度小的特點!當然單向電泳也同樣適用,只是電泳的條帶會減少!

1、在液氮中研磨葉片

2、加入樣品體積3 倍的提取液在-20℃的條件下過夜,然后離心(4℃8000rpm

以上1 小時)棄上清。

3、加入等體積的冰浴丙酮(含0.07%的β-巰基乙醇),搖勻后離心(4℃8000rpm

以上1 小時),然后真空干燥沉淀,備用。

4、上樣前加入裂解液,室溫放置30 分鐘,使蛋白充分溶于裂解液中,然后離心

(15℃8000rpm 以上1 小時或更長時間以沒有沉淀為標準),可臨時保存在4℃

待用。

5、用Brandford 法定量蛋白,然后可分裝放入-80℃?zhèn)溆谩?br />
藥品:

提取液:含10%TCA 和0.07%的β-巰基乙醇的丙酮

裂解液:2.7g 尿素0.2gCHAPS 溶于3ml 滅菌的去離子水中(終體積為5ml),

使用前再加入1M 的DTT65ul/ml

組織:腸黏膜為例

應(yīng)用TRIPURE 提取蛋白質(zhì)步驟:

含蛋白質(zhì)上清液中加入異丙醇

1.5ml 每1mlTRIPURE 用量)

倒轉(zhuǎn)混勻,置室溫10min

離心:12000 g,10min,4 度,棄上清

加入0.3M 鹽酸胍/95%乙醇

2ml 每1mlTRIPURE 用量)

振蕩,置室溫20min

離心: 7500g,5 min,4 度,棄上清

重復(fù)0.3M 鹽酸胍/95%乙醇步2 次

沉淀中加入100%乙醇2ml

充分振蕩混勻,置室溫20 min

離心: 7500g,5min,4 度,棄上清吹干沉淀

1%SDS 溶解沉淀

離心:10000g,10min,4 度

取上清-20 度保存(或可直接用于WESTERN BLOT)

存在的問題:加入1%SDS 后沉淀不溶解,還是很大的一塊,4 度離心后又多了

白色沉定,SDS 結(jié)晶?測濃度,含量才1mg/ml 左右。

解決:提蛋白試劑盒,另外組織大小適中,要碎,立即加2X BUFFER,然后煮

5-10 分鐘,效果很好的。

細菌蛋白

用甲醇提取的,凍干后用緩沖液溶解的。樣品緩沖液是一般的。其中含又2%的

SDS,20mmol 的2-巰基乙醇

腫瘤組織

0-4°C 生理鹽水沖洗組織表面血跡,以1:9(即100ug 重量加入900ul 體積)

的比例加入蛋白勻漿提取液,0-4 °C 冰水混合物中用1ml 勻漿器制成10%的蛋

白勻漿。勻漿在10000G 離心10-15 分鐘,取上清備用。

注:蛋白勻漿提取液(PH7.6):Nacl 50 mM Tris 10mM EDTA 1mM, PMSF 1 mM,

Na3 VO4 .12H2O 0.5 mM NaF 50 mM Benzamidine 1 mM

腦組織

將切取的組織用4℃預(yù)冷的0.01mol/l 的PBS 漂洗去血漬,再用濾紙吸干殘留的

PBS,將組織稱重,將0.1G 組織放入1ml 的玻璃勻漿器,加入800l 裂解液在冰

上充分勻漿,將得到的勻漿液用液氮反復(fù)凍融3 次,室溫靜置30mins,4℃

15000r/min 離心1h,小心避開脂層,吸取上清,分裝,-80℃保存。

裂解液配方如下:

尿素7mol/l

硫脲2mol/l

CHAPS 4%(m/v)

DTT 65Mmol/L(上樣前臨加)

IPG Buffer 0.5%(V/V)(上樣前臨加)

PMSF 2ug/l(m/V)(上樣前臨加)

DNA 酶1 2ug/l(m/V)(上樣前臨加)

RNA 酶A 2ug/l(m/V)(上樣前臨加)

酵母蛋白的提取方法

1 準備SD/-Leu 或是YPD 培養(yǎng)基20ml,酵母過夜培養(yǎng),30℃,230rpm。

2 測OD600 約1.0。

3 100ml 過夜培養(yǎng)物,1000g,離心,5min,4℃。

4 棄上清,重懸于80ul 抽提buffer:

0.1M Tris-Cl(PH7.5),0.2M NaCl,0.01Mβ-ME,20%甘油,5mM EDTA,1mM

PMSF。(100×)

MSF 0.1742g 溶于10ml 異戊醇(主要抑制絲氨酸蛋白激酶),

RT 保存。

5 轉(zhuǎn)移上清到一預(yù)冷的玻璃管中,再加入玻璃珠33ul(425-600um)。冰上操作,

渦流10min,但不包括樣品的預(yù)冷時間。

6 回收玻璃珠,并盡可能取上清到另一預(yù)冷的玻璃管中。

7 40ul 的抽提buffer,同上渦流。

8 離心后分離上清(回收玻璃珠)。

9 液氮快速冷凍,-70℃儲存。

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