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淺談幾種逆轉(zhuǎn)錄病毒的檢測方法
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按照中國藥典三部中，生物制品生產(chǎn)檢定用動物細(xì)胞基質(zhì)制備及質(zhì)量控制中表1的要求，逆轉(zhuǎn)錄病毒是細(xì)胞內(nèi)、外源病毒因子檢查中的重要一環(huán)，今天我們將就逆轉(zhuǎn)錄病毒的檢查要求進(jìn)行總體介紹，并于后續(xù)的推文中逐步介紹其檢查方法。 已知雞胚成纖維細(xì)胞（CEF）或其他禽源性細(xì)胞含有逆轉(zhuǎn)錄病毒序列，�？僧a(chǎn)生缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒，逆轉(zhuǎn)錄酶活性為陽性，對這類細(xì)胞進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄病毒檢測時(shí)，可直接檢測細(xì)胞基質(zhì)中是否存在外源性逆轉(zhuǎn)錄病毒污染，如禽白血病病毒、禽網(wǎng)狀內(nèi)皮病腫瘤病毒、感染性內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒。在某些情況下，也可通過監(jiān)測雞群，以保證無上述感染性逆轉(zhuǎn)錄病毒污染。 小鼠及其他嚙齒類動物來源的細(xì)胞系含有逆轉(zhuǎn)錄病毒基因序列，可能會表達(dá)內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒，因此，對于這類細(xì)胞系，應(yīng)進(jìn)行感染性試驗(yàn)，以確定所表達(dá)的逆轉(zhuǎn)錄病毒是否具有感染性。對于特定嚙齒類細(xì)胞（如 CHO、BHK21、NS0 和 Sp2/0），還應(yīng)確定其收獲液中病毒顆粒的量及其是否有感染性逆轉(zhuǎn)錄病毒，并應(yīng)在生產(chǎn)工藝中增加病毒去除和（或）滅活工藝。僅有高度純化且可證明終產(chǎn)品中逆轉(zhuǎn)錄病毒被清除至低于現(xiàn)行檢測方法的檢測限以下時(shí)，方可使用這類細(xì)胞。 可采用下列方法對待檢細(xì)胞進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄病毒的檢測： 一、逆轉(zhuǎn)錄酶活性測定 采用敏感的方法，如產(chǎn)物增強(qiáng)的逆轉(zhuǎn)錄酶活性測定法（ PERT 或 PBRT 法）（生物制品生產(chǎn)檢定用動物細(xì)胞基質(zhì)制備及質(zhì)量控制 附錄 1 或其他適宜的方法，但靈敏度不得低于現(xiàn)行方法）[1]，但由于細(xì)胞中某些成分也具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性；因此，逆轉(zhuǎn)錄酶陽性的細(xì)胞，應(yīng)進(jìn)一步確認(rèn)是否存在感染性逆轉(zhuǎn)錄病毒。 二、透射電鏡檢查法 取至少 1×107 個(gè)活細(xì)胞采用超薄切片法進(jìn)行透射電鏡觀察。 三、PCR 法或其他特異性體外法 根據(jù)細(xì)胞的種屬特異性，在逆轉(zhuǎn)錄酶活性結(jié)果不明確或不能采用逆轉(zhuǎn)錄酶活性測定時(shí)，可采用種屬特異性的逆轉(zhuǎn)錄病毒檢測法，如逆轉(zhuǎn)錄病毒 PCR 法、免疫熒光法、ELISA 法等，逆轉(zhuǎn)錄病毒的定量 PCR 法還可用于逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒的定量。 四、感染性試驗(yàn) 將待檢細(xì)胞感染逆轉(zhuǎn)錄病毒敏感細(xì)胞，培養(yǎng)后檢測。根據(jù)待檢細(xì)胞的種屬來源，須使用不同或多種的敏感細(xì)胞進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄病毒感染性試驗(yàn)。 |
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