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斯坦德檢測集團(tuán)新蟲 (初入文壇)
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[交流]
美國藥典中的支原體檢測
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支原體是一類沒有細(xì)胞壁，能夠自我復(fù)制的，可以通過過濾器并能夠通過人工培養(yǎng)增殖的原核微生物，其不能進(jìn)行革蘭氏染色，但染色時(shí)會(huì)留下菌落的印記。 支原體是寄生蟲和共生體，有些可能對(duì)多種動(dòng)植物宿主致病。在人類中，支原體通常是表面寄生蟲定植于呼吸道和泌尿道的上皮內(nèi)壁，感染可能會(huì)持續(xù)很長時(shí)間，而不會(huì)引起明顯的細(xì)胞損傷。培養(yǎng)物中細(xì)胞的感染幾乎可以影響細(xì)胞代謝的每一條途徑，包括細(xì)胞表型特征的改變和正常生長。 由于支原體本身的特性，使其不易被清除，支原體污染對(duì)于生物技術(shù)產(chǎn)品的研究和生產(chǎn)是一個(gè)嚴(yán)重且普遍的問題。為了確保生物技術(shù)產(chǎn)品和用于生產(chǎn)這些產(chǎn)品的相關(guān)材料的安全性，支原體檢測是必要的質(zhì)量控制措施。 根據(jù)美國藥典第63章節(jié)，直接培養(yǎng)法是根據(jù)支原體在液體培養(yǎng)基生長過程中，以不同的生長方式導(dǎo)致液體培養(yǎng)基的pH發(fā)生變化，從而使含有酚紅的液體培養(yǎng)基發(fā)生顏色變化，并根據(jù)液體培養(yǎng)基的傳代平板的生長情況判定檢測產(chǎn)品是否抑制支原體的生長。 指示細(xì)胞培養(yǎng)法是通過能夠與支原體核酸結(jié)合的熒光染料對(duì)指示細(xì)胞進(jìn)行染色，通過指示細(xì)胞在熒光顯微鏡下觀察是否有支原體熒光判定檢測產(chǎn)品是否抑制支原體的生長。 直接培養(yǎng)法： 實(shí)驗(yàn)周期為28天，在第0天，需要進(jìn)行液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基接種，包括陰性對(duì)照，供試品檢測，陽性對(duì)照和干擾實(shí)驗(yàn)。以空白培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照，以口腔支原體和肺炎支原體作為陽性對(duì)照，分別將10 mL的陰性對(duì)照，供試品，陽性對(duì)照和供試品與支原體的混合溶液接種到100 mL的液體培養(yǎng)基中，支原體的接種總量不大于100 CFU，將接種后的液體培養(yǎng)基置于36±1 ℃的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間不超過21天，并在培養(yǎng)期間，2-3天觀察一次液體培養(yǎng)基的顏色變化。 將陰性對(duì)照，供試品，陽性對(duì)照和供試品與支原體的混合溶液接種于支原體瓊脂培養(yǎng)基上，支原體的接種總量不大于100 CFU，接種后將支原體瓊脂平板置于36±1 ℃，5-10% CO2，＜0.5% O2的環(huán)境中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)14天后對(duì)支原體在顯微鏡進(jìn)行計(jì)數(shù)。 在2-4天，6-8天，13-15天，19-21天對(duì)液體培養(yǎng)基進(jìn)行傳代培養(yǎng)，從液體培養(yǎng)基中吸取0.2 mL培養(yǎng)物，接種在支原體瓊脂培養(yǎng)基上，至少接種一塊，接種后放入36±1℃，5-10%CO2，＜0.5%O2的環(huán)境中進(jìn)行培養(yǎng)，除了19-21天的培養(yǎng)物培養(yǎng)7天外，其余傳代批次的培養(yǎng)物需培養(yǎng)14天。對(duì)于陽性對(duì)照和干擾實(shí)驗(yàn)的傳代，需要先觀察上次傳代平板的結(jié)果，若上次傳代的平板有支原體生長，則無需繼續(xù)進(jìn)行傳代，并結(jié)束實(shí)驗(yàn)。 指示細(xì)胞培養(yǎng)法： 實(shí)驗(yàn)周期為7天，指示細(xì)胞密度需在2E4 cells/mL-2E5 cells/mL范圍內(nèi)。 在第0天，進(jìn)行陰性對(duì)照，供試品檢測，陽性對(duì)照和干擾實(shí)驗(yàn)的接種，以空白培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照，以口腔支原體和豬鼻支原體作為陽性對(duì)照。將1 mL的陰性對(duì)照，供試品，陽性對(duì)照和供試品與支原體的混合溶液接種至指示細(xì)胞，接種后置于36±1℃進(jìn)行培養(yǎng)。 在第3天，進(jìn)行指示細(xì)胞的傳代培養(yǎng)，將陰性對(duì)照，供試品檢測，陽性對(duì)照和干擾實(shí)驗(yàn)的指示細(xì)胞接種至六孔板中；傳代后繼續(xù)培養(yǎng)3-5天，使用二苯甲酰胺熒光染料對(duì)指示細(xì)胞進(jìn)行染色。染色后在熒光顯微鏡下對(duì)指示細(xì)胞進(jìn)行觀察。根據(jù)觀察結(jié)果判定供試品是否對(duì)支原體的生長存在抑制作用。 參考文獻(xiàn) <1>.United States Pharmacopoeia 63 |
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