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科研顧問_Gu新蟲 (小有名氣)
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干貨分享 ｜ 免疫組化（IHC），原來如此簡單！
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免疫組化，是應用免疫學基本原理-抗原抗體反應，即抗原與抗體特異性結合的原理，通過化學反應使標記抗體的顯色劑(熒光素、酶、金屬離子、同位素)顯色來確定組織細胞內(nèi)抗原(多肽和蛋白質)，對其進行定位、定性及相對定量的研究，稱為免疫組織化學技術或免疫細胞化學技術。 一、原理 根據(jù)抗原抗體反應和化學顯色原理，組織切片或細胞標本中的抗原先和一抗結合，再利用一抗與標記生物素、熒光素等的二抗進行反應，前者再用標記辣根過氧化物酶(HRP)或堿性磷酸酶(AKP)等的抗生物素(如鏈霉親和素等)結合，最后通過呈色反應或熒光來顯示細胞或組織中化學成分，在光學顯微鏡或熒光顯微鏡下可清晰看見細胞內(nèi)發(fā)生的抗原抗體反應產(chǎn)物，從而能夠在細胞爬片或組織切片上原位確定某些化學成分的分布和含量。 二、分類 1、按照標記物的種類，如熒光染料、放射性同位素、酶(主要有辣根過氧化物酶和堿性磷酸酶)、鐵蛋白、膠體金等，可分為免疫熒光法、免疫酶法、免疫鐵蛋白法、免疫膠體金法及放射免疫自顯影法等。 1）免疫熒光法 將已知抗體標上熒光素，以此作為探針檢查細胞或組織內(nèi)的相應抗原，在熒光顯微鏡下觀察，當抗原抗體復合物中的熒光素受激發(fā)光的照射后會發(fā)出一定波長的熒光，從而可以確定組織中的抗原定位或定量。 2）免疫酶標法 基本原理是先以酶標記的抗體與組織或細胞作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性產(chǎn)物或具有一定電子密度的顆粒，通過光鏡或電鏡，對細胞表面和細胞內(nèi)的各種抗原成分進行定位研究。 3）免疫膠體金技術 免疫膠體金技術是以膠體金這樣一種特殊的金屬顆粒作為標記物。膠體金是指金的水溶膠，它能迅速而穩(wěn)定地吸附蛋白，對蛋白的生物學活性則沒有明顯的影響。因此，用膠體金標記一抗、二抗或其他能特異性結合免疫球蛋白的分子(如葡萄球菌A蛋白)等作為探針，就能對組織或細胞內(nèi)的抗原進行定性、定位，甚至定量研究。 由于膠體金有不同大小的顆粒，且膠體金的電子密度高，所以免疫膠體金技術特別適合于免疫電鏡的單標記或多標記定位研究。由于膠體金本身呈淡至深紅色，因此也適合進行光鏡觀察。如應用銀加強的免疫金銀法則更便于光鏡觀察。 2、按染色步驟可分為直接法(又稱一步法)和間接法(二步、三步或多步法)。與直接法相比，間接法的靈敏度提高了許多。 3、按結合方式可分為抗原-抗體結合，如過氧化物酶-抗過氧化物酶(PAP)法；親和連接，如卵白素-生物素-過氧化物酶復合物(ABC)法、鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(SP)法等，其中SP法是比較常用的方法；聚合物鏈接，如即用型二步法，此方法尤其適合于內(nèi)源性生物素含量高的組織抗原檢測。 ①免疫組化的原理就是一抗結合到目標蛋白，再有二抗來進行信號放大。 ②二抗的信號放大有多種方法，取決于二抗標記方法的選擇，簡單的二抗標記方法是直接法，就是直接在二抗上標記酶，比如HRP，來進行顯色，這樣的二抗實際上很便宜，但是缺點就是靈敏度低，好多低豐度的蛋白，結合不上，免疫組化染出來的效果就不太好。 ③第二種方法，叫做PAP，比如二抗標記了HRP，他們就在孵育二抗后，再孵育一種能結合HRP的一抗。這種方法靈敏度上去了，但是非特異性增高了。 ④第三種方法被稱為ABC法或者SABC法，主要是在二抗上標記生物素，孵育二抗后，加入親和素以及標記了HRP的生物素，以這樣的聚合方式，來進行信號的放大作用。這種方法的優(yōu)點是能夠成倍提高靈敏度，但同時也會提高非特異性，于是就產(chǎn)生了第四種方法，LSAB法標記的二抗： 這種方法，直接在親和素上加上HRP標記，靈敏度也很高，同時降低了SABC法的非特異性。而且，LSAB法在實驗的時一般孵育時間短(通常就10分鐘)。 ⑤SABC法和LSAB法在實驗過程中需要進行內(nèi)源生物素封閉，操作復雜些，于是產(chǎn)生了第五種標記方法，也就是Polymer法，就是在二抗上標記聚合的HRP：這樣二抗的信號就得到了放大，靈敏度也提高了，但Polymer法、SABC法、LSAB法，都不能用于定量實驗，只能用在IHC上。 免疫熒光主流是采用直接法、LSAB法，以及直接標記或者LSAB標記的三抗來進行信號放大的�？偨Y一下，就是直接法的二抗便宜但是靈敏度差；PAP法基本已經(jīng)淘汰，LSAB和SABC法的靈敏度高，但是貴，步驟多；Polymer法靈敏度高，步驟簡單，但是貴。 三、方法 1、SP三步法 a.脫蠟：60℃ 20min；二甲苯I 10min 、二甲苯II 10min。 b.梯度水化：100%EtOH I 5min 、100%EtOH II 5min、95%EtOH 3min、80% EtOH 3min、70% EtOH 3min。 c.滅活內(nèi)源性過氧化物酶：3%H₂O₂常溫下避光孵育10min，PBS沖洗3次×3min。 d.抗原修復：置0.01M枸櫞酸緩沖液(PH 6.0)中用煮沸(微波爐可高火4次×6min)，自然冷卻30min以上，至室溫后PBS沖洗3次×3min。 e.封閉：用封閉液(一般與二抗來源一致，如正常羊血清工作液)封閉，常溫下10~30min，傾去勿洗。 f.一抗孵育：滴加適宜濃度的一抗4℃冰箱孵育過夜(最常用)，37℃復溫45min，PBS沖洗5次×3min(用PBS緩沖液代替一抗作陰性對照)。 g.二抗孵育：滴加生物素標記二抗，37℃孵育30min, PBS沖洗5次×3min。 h.SP反應：滴加辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素工作液，37℃孵育30min，PBS沖洗5次×3min。 i.DAB顯色：配置DAB/H₂O₂反應液孵育組織切片，鏡下控制染色，一般3~10min，自來水充分沖洗。 j.蘇木素復染：一般胞漿蛋白或胞膜蛋白可以適當染至幾十秒~幾分鐘，但細胞核蛋白在幾秒。若過染，可以用1%HCl褪色。 k.常規(guī)脫水：50% ethanol 1-2min、70% ethanol 1-2min、95% ethanol 1-2min、95% ethanol 1-2min、100% absolute ethanol: (1-2)min、100% absolute ethanol: (1-2)min。 l.透明：Xylene 1×(1-2)min→Xylene 2×(1-2)min； m.封片：中性樹膠。 2、免疫組化的關鍵環(huán)節(jié) ①脫蠟和水化 這是為了后面的抗體等試劑能夠充分與組織中抗原等結合反應。脫蠟可以先60℃20min，然后立即二甲苯1-3分別10min(這個時間是由二甲苯新鮮程度和室溫等綜合決定的)，但當天制好的切片一般先60℃ 3-4h。水化用梯度乙醇(由高到低)。若脫蠟和水化不全易出現(xiàn)局灶性反應和浸洗不全，而產(chǎn)生非特異性背景著色。 ②抗原修復 由于組織中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固定過程中，發(fā)生了蛋白之間交聯(lián)及醛基的封閉作用，從而失去抗原性；通過抗原修復，使得細胞內(nèi)抗原決定簇重新暴露，提高抗原檢測率。常用的修復方法從強到弱一般分為三種，高壓修復、微波修復、胰酶修復。修復液也分為若干種(中性的、高pH的等)。 ③滅活內(nèi)源性過氧化物酶和生物素 在傳統(tǒng)的ABC法和SP法中，免疫組化反應結果容易收到內(nèi)源性過氧化物酶和生物素的干擾，必須用過氧化氫和卵白素等進行滅活。滅活內(nèi)源性過氧化物酶一般3%過氧化氫滅活時間短點，可以10min左右，而0.3%過氧化氫則可以適當延長封閉時間，一般10~30min。 用甲醇配置過氧化氫比雙蒸水或PBS可能好在保護抗原和固定組織作用，過氧化氫孵育時間過長易引起脫片；現(xiàn)用現(xiàn)配，配好后4℃避光保存。 ④血清封閉 組織切片上有剩余的位點可以與一抗非特異性結合，造成后續(xù)結果的假陽性；封閉血清一般是和二抗同一來源的，血清中動物自身的抗體，預先能和組織中有交叉反應的位點發(fā)生結合；也可以用小牛血清、BSA、羊血清等，但不能與一抗來源一致。一般室溫10-30min。但也要防止封閉過度。 ⑤一抗和二抗?jié)舛群头跤龝r間 一抗孵育條件在免疫組化反應中最重要，包括孵育時間、溫度和抗體濃度。一抗孵育溫度有幾種：4℃、室溫、37℃，其中4℃效果最佳；孵育時間：這與溫度、抗體濃度有關，一般37℃1-2h，而4℃過夜和從冰箱拿出后37℃復溫45min。 二抗孵育條件：二抗一般室溫或37℃ 30min-1h，而濃度一般有工作液�？贵w稀釋液一般就用PBS即可，但專用的抗體稀釋液中除PBS成份外，還加了疊氮化鈉防腐劑、BSA穩(wěn)定劑等組份，對抗體的多次回收利用較好。 ⑥切片清洗(浸洗、沖洗和漂洗) 為了防止一抗、二抗等試劑殘留而引起非特異性染色，所以適當?shù)丶訌娗逑?延長時間和增多次數(shù))尤為重要。 注意：a.單獨沖洗，防止交叉反應造成污染。b.溫柔沖洗(浸洗方式)，防止切片的脫落。c.沖洗的時間要足夠，才能徹底洗去結合的物質。d.PBS的PH和離子強度的使用和要求。建議PH在7.4-7.6濃度是0.01M。(中性及弱堿性條件(PH7-8)有利于免疫復合物的形成，而酸性條件則有利于分解；低離子強度有利于免疫復合物的形成，而高離子強度則有利于分解)。 ⑦DAB顯色 背景的深淺和特異性染色的深淺均可以由DAB孵育條件決定。DAB顯色時間不是固定的，主要由顯微鏡下控制顯色時間，到出現(xiàn)特異性染色較強而本底著色較淺時即可沖洗；DAB顯色時間很短(如幾秒或幾十秒)就出現(xiàn)很深的棕褐色，這很可能說明實驗的抗體濃度過高或抗體孵育時間過長，需要下調(diào)抗體濃度或縮短實驗的抗體孵育時間。 此外，若很短時間就出現(xiàn)背景很深，還有可能實驗前面的封閉非特異性蛋白不全，需要延長封閉時間；DAB顯色時間很長(如超過十幾分鐘)才出現(xiàn)陽性染色，一方面可能說明實驗者的抗體濃度過低或孵育時間過短(最好一抗4℃過夜)；另一方面就是封閉時間過長。 ⑧復染 目的是形成細胞輪廓，從而更好地對目標蛋白進行定位，經(jīng)常用蘇木素復染(胞核染料)。注意蘇木素復染時間要看當時的室溫、溶液的新舊、目標抗原的定位等情況，一般數(shù)秒-數(shù)分鐘，胞漿蛋白可以適當時間長一點，而胞核蛋白則要短。 不過這個如果染色不理想可以補救的。方法是：染色深則分化時間稍長些即可；染色淺則再置于蘇木素中染色即可。鹽酸酒精是分化，氨水是返藍。作用不同。片子復染完后流水振洗，然后置于鹽酸酒精中數(shù)秒(一定動作要快)后拿出流水振洗，在放入氨水中返蘭即可。 ⑨脫水透明 免疫組化對標本處理最后的脫水透明需要采用由低至高的梯度酒精脫水，是避免直接將組織投入高濃度酒精中而造成組織過度收縮。 ⑩封片 為了長期保存，實驗人員一般用中性樹膠等封片，避免產(chǎn)生氣泡，方法是直接在載玻片組織上滴一滴封片液，然后一手拿住蓋片某一拐角，而另一手拿對面的那個拐角，接近封片液近端的拐角先降低，直至接觸到液體時為止；當發(fā)現(xiàn)液體接觸面在不斷彌散時，則可以緩慢降低另一拐角，這樣一般不會產(chǎn)生氣泡。 四、異常分析 1、非特異性染色 ①抗體孵育時間過長、抗體濃度高易增加背景著色。這可通過縮短一抗/二抗孵育時間、稀釋抗體來控制。 ②一抗用多克隆抗體易出現(xiàn)非特異性著色，建議試用單克隆抗體。 ③內(nèi)源性過氧化物酶和生物素在肝臟、腎臟等組織含量很高(含血細胞多的組織)，需要通過延長滅活時間和增加滅活劑濃度來降低背景染色。 ④非特異性組分與抗體結合，這需要通過延長二抗來源的動物免疫血清封閉時間和適當增加濃度來加強封閉效果。 ⑤DAB孵育時間過長或濃度過高。 ⑥PBS沖洗不充分，殘留抗體結果增強著色，在一抗/二抗/SP孵育后的浸洗尤為重要。 ⑦標本染色過程中經(jīng)常出現(xiàn)干片，這容易增強非特異性著色。 2、呈陰性結果 ①抗體濃度和質量問題以及抗體來源選擇錯誤。不是抗體濃度越高就越易出現(xiàn)陽性結果，抗原抗體反應有前帶和后帶效應，必須摸索最佳濃度。 ②抗原修復不全，對于甲醛固定的組織必須用充分抗原修復來打開抗原表位，以利于與抗體結合。 ③組織切片本身這種抗原含量低。 ④血清封閉時間過長。DAB孵育時間過短。 ⑤細胞通透不全，抗體未能充分進入胞內(nèi)參與反應。 五、應用 1、臨床應用：惡性腫瘤的診斷與鑒別診斷；確定轉移性惡性腫瘤的原發(fā)部位；對某類腫瘤進行進一步的病理分型。 2、免疫組化鏡檢：定位抗體的表達部位(細胞間質、細胞膜、細胞漿、核膜、細胞核等或表達組織)。 3、細胞凋亡檢測：正常凋亡細胞通過檢測凋亡細胞DNA片段進行染色，正常的、人為造成凋亡的細胞很少能夠被染色。以甲基綠復染，便于從形態(tài)學上分辨評估正常細胞和凋亡細胞。 |
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