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科研顧問_Gu新蟲 (小有名氣)
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干貨分享 | 蛋白定量的3種常用方法 已有1人參與
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蛋白質(zhì)含量可從它們的物理化學(xué)性質(zhì)，如折射率、比重，紫外吸收、染色等測定而得知；或用化學(xué)方法，如定氮、雙縮脲反應(yīng)、 folin-酚試劑反應(yīng)、BCA法等方法來測定。 一、比色法 蛋白定量常使用的方法是比色法，通常用于總蛋白的定量分析。根據(jù)蛋白和比色試劑的結(jié)合，可以將比色法分為：蛋白-染料結(jié)合法和蛋白-銅螯合化學(xué)試劑法。前者對應(yīng)的典型蛋白定量比色法是考馬斯亮藍(lán)G250染料結(jié)合法，后者則包括雙縮脲法，Lowry法，二喹啉甲酸(BCA)法。 1、Bradford法 Bradford法原理是在酸性溶液中，考馬斯亮藍(lán)G250通過與蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸(精氨酸)和芳香族氨基酸殘基相結(jié)合，使染料的最大吸收峰位置由488nm變?yōu)?95nm，顏色從棕紅色變?yōu)樗{(lán)色。結(jié)合到蛋白質(zhì)分子上的染料數(shù)與蛋白所帶正電荷成正比，通過顏色的強(qiáng)弱即可測定蛋白質(zhì)濃度的高低，因此可以用該方法來對蛋白進(jìn)行定量。 因染料主要與蛋白質(zhì)中精氨酸和芳香族氨基酸殘基相結(jié)合，且兩者在各種蛋白質(zhì)含量不同，故用于不同蛋白質(zhì)測定時有較大偏差，另外范德華力和疏水作用也會影響蛋白與染料的結(jié)合。 Bradford法測定蛋白濃度不受絕大部分樣品中的化學(xué)物質(zhì)的影響，如：K⁺、Na⁺、Mg²⁺離子、Tris緩沖液、糖和蔗糖、甘油、EDTA、DTT、TCEP和β-巰基乙醇等。但需要注意的是：由于高濃度洗滌劑會影響檢測結(jié)果的可靠性，必須確保樣品中的SDS的濃度低于1％，Triton X-100低于0.1％，Tween20,60,80低于0.06％。 檢測蛋白濃度的考馬斯亮藍(lán)和染色PAGE膠的考馬斯亮藍(lán)不是同一種物質(zhì)，前者采用考馬斯亮藍(lán)G250，后者采用考馬斯亮藍(lán)R250；G250和R250分子基本骨架一樣，但是G250多了兩個甲基，與蛋白反應(yīng)迅速，染膠慢且脫色困難，故用于蛋白定量；R250與蛋白反應(yīng)較緩慢，染膠較快且易于洗脫，故用于PAGE膠染色。 2、 BCA法 BCA(bicinchoninic acid，二辛可酸)法測定蛋白的原理：二價銅離子在堿性條件下可以被蛋白質(zhì)還原成一價銅離子，一價銅離子和含有BCA的溶液相互作用產(chǎn)生敏感的顏色反應(yīng)。兩分子的BCA螯合一個銅離子，形成紫色的反應(yīng)復(fù)合物。 該水溶性的復(fù)合物在562nm處顯示強(qiáng)烈的吸光性，吸光度和蛋白濃度在廣泛范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，并于標(biāo)準(zhǔn)曲線對比，因此根據(jù)吸光值可以推算出蛋白濃度。 BCA法容易受到能與銅離子反應(yīng)的螯合劑例如EDTA，還原性試劑(β-巰基乙醇)以及蛋白質(zhì)內(nèi)半胱氨酸等的影響。 3、雙縮脲法 雙縮脲是三分子的脲經(jīng)180℃左右加熱，放出一份子氨后得到的產(chǎn)物，在強(qiáng)堿性溶液中，雙縮脲與硫酸銅可形成紫色絡(luò)合物(肽鏈中的氮原子和銅離子配價結(jié)合)，稱為雙縮脲反應(yīng)。 紫色絡(luò)合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)的含量成正比，而與蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量及氨基酸成分無關(guān)，故可用來測定蛋白質(zhì)含量。測定范圍1-10mg蛋白質(zhì)。 雙縮脲法常用于需要快速但并不需要十分精確的測定。硫酸銨不干擾此呈色反應(yīng)，使其有利于對蛋白質(zhì)純化早期步驟的測定。干擾此測定的物質(zhì)包括在性質(zhì)上是氨基酸或肽的緩沖劑，例如Tris緩沖液，因為它們給予陽性呈色反應(yīng)。Cu²⁺也容易被還原，有時發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)紅色沉淀。 4、Folin-酚試劑法(Lowry法) 用于蛋白質(zhì)測定的Lowry反應(yīng)是雙縮脲方法的發(fā)展，第一步涉及到在堿性溶液中銅-蛋白質(zhì)復(fù)合物的形成(蛋白質(zhì)中的肽鍵和銅離子結(jié)合產(chǎn)生雙縮脲反應(yīng))，F(xiàn)olin-酚試劑中的磷鉬酸-磷鎢酸試劑被銅-蛋白質(zhì)復(fù)合物中蛋白質(zhì)的酪氨酸和苯丙氨酸殘基還原，產(chǎn)生深藍(lán)色的鉬藍(lán)和鎢藍(lán)的混合物。在一定條件下，藍(lán)色深度與蛋白的量成正比，由此可測定蛋白質(zhì)的含量。 這個測定法較雙縮脲法靈敏得多。對雙縮脲反應(yīng)發(fā)生干擾的離子同樣容易干擾Lowry反應(yīng)，而且對后者的影響還要大得多。所測蛋白質(zhì)樣品中若含酚類及檸檬酸均有干擾作用。 二、紫外法 蛋白質(zhì)分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，使蛋白質(zhì)具有吸收紫外光的性質(zhì)。吸收高峰在280nm處，其吸光度(即光密度值)與蛋白質(zhì)含量成正比。此外，蛋白質(zhì)溶液在238nm的光吸收值與肽鍵含量成正比。利用一定波長下，蛋白質(zhì)溶液的光吸收值與蛋白質(zhì)濃度的正比關(guān)系，可以進(jìn)行蛋白質(zhì)含量的測定。 此法的特點是測定蛋白質(zhì)含量的準(zhǔn)確度較差，干擾物質(zhì)多，在用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定蛋白質(zhì)含量時，對那些與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸含量差異大的蛋白質(zhì)，有一定的誤差。故該法適于用測定與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)氨基酸組成相似的蛋白質(zhì)。若樣品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物質(zhì)，會出現(xiàn)較大的干擾。 1、280nm的光吸收法 因蛋白質(zhì)分子中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸在280nm處具有最大吸收，且各種蛋白質(zhì)的這三種氨基酸的含量差別不大，因此測定蛋白質(zhì)溶液在280nm處的吸光度值是最常用的紫外吸收法。 測定時，將待測蛋白質(zhì)溶液倒入石英比色皿中，用配制蛋白質(zhì)溶液的溶劑(水或緩沖液)作空白對照，在紫外分光度計上直接讀取280nm的吸光度值A(chǔ)280。蛋白質(zhì)濃度可控制在0.1-1.0mg/ml左右。通常用1cm光徑的標(biāo)準(zhǔn)石英比色皿，盛有濃度為1mg/ml的蛋白質(zhì)溶液時，A280約為1.0左右。由此可立即計算出蛋白質(zhì)的大致濃度。 2、280nm和260nm的吸收差法 核酸對紫外光有很強(qiáng)的吸收，在280nm處的吸收比蛋白質(zhì)強(qiáng)10倍，但核酸在260nm處的吸收更強(qiáng)，其吸收高峰在260nm附近。核酸260nm處的消光系數(shù)是280nm處的2倍，而蛋白質(zhì)則相反，280nm紫外吸收值大于260nm的吸收值。 通常：純蛋白質(zhì)的光吸收比值：A280/A260=1.8；純核酸的光吸收比值：A280/A260= 0.5。含有核酸的蛋白質(zhì)溶液，可分別測定其A280和A260，由此吸收差值，用經(jīng)驗公式(蛋白質(zhì)濃度(mg/ml)=1.45×A280-0.74×A260)，即可算出蛋白質(zhì)的濃度。 3、215nm與225nm的吸收差法 蛋白質(zhì)的稀溶液由于含量低而不能使用280nm的光吸收測定時，可用215nm與225nm吸收值之差，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線法來測定蛋白質(zhì)稀溶液的濃度。 用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，配制成20-100mg/ml的一系列5.0ml的蛋白質(zhì)溶液，分別測定215nm和225nm的吸光度值，并計算出吸收差：吸收差d=A215-A225。以吸收差d為縱座標(biāo)，蛋白質(zhì)濃度為橫座標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。再測出未知樣品的吸收差，即可由標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出未知樣品的蛋白質(zhì)濃度。 4.肽鍵測定法 蛋白質(zhì)溶液在238nm處的光吸收的強(qiáng)弱，與肽鍵的多少成正比。因此可以用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液配制一系列50-500mg/ml已知濃度的5.0ml蛋白質(zhì)溶液，測定238nm的光吸收值A(chǔ)238，以A238為縱座標(biāo)，蛋白質(zhì)含量為橫座標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。未知樣品的濃度即可由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得。 本方法比280nm吸收法靈敏。但多種有機(jī)物，如醇、酮、醛、醚、有機(jī)酸、酰胺類和過氧化物等都有干擾作用。所以最好用無機(jī)鹽，無機(jī)堿和水溶液進(jìn)行測定。若含有有機(jī)溶劑，可先將樣品蒸干，或用其他方法除去干擾物質(zhì)，然后用水、稀酸和稀堿溶解后再作測定。 三、凱氏定氮法 1、原理 蛋白質(zhì)是含氮的有機(jī)化合物。樣品與濃硫酸和催化劑一同加熱消化，使蛋白質(zhì)分解，其中碳和氫被氧化為二氧化碳和水逸出，而樣品中的有機(jī)氮轉(zhuǎn)化為氨；氨與硫酸結(jié)合生成硫酸銨。加堿蒸餾使氨游離，用硼酸吸收后，再以硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，根據(jù)酸的消耗量乘以換算系數(shù)(如乳及乳制品換算系數(shù)為6.38)，即為蛋白質(zhì)的含量。 2、過程 1）消化 濃硫酸具有脫水性，使有機(jī)物脫水后被炭化為碳、氫、氮。濃硫酸又具有氧化性，可將有機(jī)物炭化后的碳氧化為二氧化碳，硫酸則被還原為二氧化硫。二氧化硫使氮還原為氨，本身則被氧化為三氧化硫，氨隨之與硫酸作用生成硫酸銨留在酸性溶液中。 蛋白質(zhì)+13H₂SO₄→(NH₄  ₂SO₄+6CO₂+12SO₂+16H₂O消化時加入的硫酸銅是作催化劑，以加速分解反應(yīng)，還可以加入氧化汞、氧化銅等作催化劑，為防止汞的污染，通常用硫酸銅較多。如果以汞或汞化合物作催化劑，則消化和加堿后，形成汞氨化合物。此化合物在蒸餾時不能完全分解，在這種情況下，必須加入鋅粉或硫代硫酸鈉或硫化鈉，使汞氨化合物分解。 C+2CuSO₄→Cu₂SO₄+SO₂↑+CO₂↑ Cu₂SO₄+2H₂SO₄→2CuSO₄+2H₂O+SO₂ 有機(jī)物消化完后，溶液具有清澈的硫酸銅的藍(lán)綠色，同時硫酸銅在下一步蒸餾時可作堿性反應(yīng)的指示劑。 在消化過程中添加硫酸鉀，與硫酸反應(yīng)生成硫酸氫鉀，是為了提高溶液沸點，從而提高反應(yīng)溫度，加速反應(yīng)過程。此外，也可以加硫酸鈉、氯化鉀等鹽類來提高沸點。 在消化過程中，隨著硫酸的不斷分解、水分的不斷蒸發(fā)，硫酸鉀的濃度逐漸增大，沸點升高，加速了對有機(jī)物的分解作用。 加入過氧化氫，是利用其氧化性，以加快反應(yīng)速度：2H₂O₂→O₂+2H₂O 2）蒸餾 在消化完全的樣品溶液中加入濃氫氧化鈉使呈堿性，硫酸銨在堿性條件下釋放出氨，通過加熱蒸餾，氨隨水蒸氣蒸出：(NH₄ ₂SO₄+2NaOH →2NH₃+Na₂SO₄+2H₂O3）吸收 加熱蒸餾時放出的氨可用硼酸溶液進(jìn)行吸收：2NH₃+4H₃BO₃→(NH4)₂B₄O₇+5H₂O 4）滴定 待吸收完全后，用硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定生成的硼酸銨，屬于鹽類的滴定。硼酸為極弱的酸，在滴定中并不影響所用指示劑的變色反應(yīng)。 (NH₄ ₂B₄O₇+H₂SO₄+5H₂O→(NH₄₂SO₄+4H₃BO₃(NH₄ ₂B₄O₇+2HCl+5H₂O→2NH₄Cl+4H₃BO₃5）計算 根據(jù)硫酸或鹽酸溶液消耗的體積，計算總氮含量，再乘以蛋白質(zhì)系數(shù)（乳及乳制品換算系數(shù)為6.38），即為粗蛋白的含量。 |
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