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斯坦德檢測(cè)集團(tuán)新蟲 (初入文壇)
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菌種檢定-16S rDNA測(cè)序技術(shù)介紹
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一、簡(jiǎn)介 微生物鑒定是指借助現(xiàn)有的分類系統(tǒng)，通過對(duì)未知微生物的特征測(cè)定，對(duì)其進(jìn)行細(xì)菌、酵母菌和霉菌大類的區(qū)分，或?qū)�、種及菌株水平確定的過程，它是藥品微生物檢驗(yàn)中的重要環(huán)節(jié)。菌種鑒定的常規(guī)手段包括形態(tài)學(xué)觀察、生理生化特性鑒定和分子生物學(xué)鑒定等，而通過分子生物學(xué)的方法進(jìn)行菌種鑒定不受生長(zhǎng)培養(yǎng)基或分離物活性的影響，只需分離到純菌落便可用于分析，更為直接和可靠。通過對(duì)細(xì)菌16S核糖體RNA(16S ribosomal RNA gene，16S rRNA)基因特征序列的測(cè)定，可實(shí)現(xiàn)細(xì)菌的生物學(xué)鑒定。 核糖體RNA按沉降系數(shù)分為5S、16S和23S rRNA。16S rRNA為核糖體的RNA的一個(gè)亞基，16S rDNA就是編碼該亞基的基因，存在于所有細(xì)菌的基因組中。16S rDNA是細(xì)菌的系統(tǒng)分類研究中最有用的和最常用的分子鐘，由于大小適中，約1.5kb左右，既能體現(xiàn)不同菌屬之間的差異，又能利用測(cè)序技術(shù)較容易地得到其序列。 二、檢測(cè)方法 1．使用商品化試劑盒提取細(xì)菌DNA，并用超微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA濃度。 2．選擇16S rDNA保守區(qū)引物對(duì)細(xì)菌基因組上16S rDNA序列進(jìn)行擴(kuò)增，使用27F/1492R引物對(duì)擴(kuò)增可獲得包含V1-V9高變區(qū)的序列。 3．采用瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)核酸擴(kuò)增產(chǎn)物。在紫外凝膠成像儀上檢視，核酸擴(kuò)增產(chǎn)物應(yīng)在約1500bp的位置出現(xiàn)一條目的條帶。 4．根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳膠圖選擇切膠回收或者酶消化的方式純化擴(kuò)增產(chǎn)物，以去除擴(kuò)增產(chǎn)物中的多余引物或非特異性擴(kuò)增條帶。 5．使用擴(kuò)增引物作為測(cè)序引物分別進(jìn)行測(cè)序PCR擴(kuò)增。 6．通過磁珠法或商品化試劑盒對(duì)測(cè)序PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化，去除多余的染料。 7．使用3500XL基因分析儀對(duì)純化后的測(cè)序PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)。 8．去除測(cè)序結(jié)果前后端部分序列后，使用NCBI等數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，根據(jù)比對(duì)結(jié)果判斷樣本所屬種屬。 參考文獻(xiàn) [1]Molecular Approaches to Studying Microbial Communities: Targeting the 16S Ribosomal RNA Gene - Scientific Figure on ResearchGate. Available from: https://www.researchgate.net/fig ... cate_fig2_308040658 [accessed 13 May, 2024] [2]中國(guó)藥典2020版四部通則1021 細(xì)菌DNA特征序列鑒定法 [3]中國(guó)藥典2020版四部指導(dǎo)原則9204 微生物鑒定指導(dǎo)原則 |
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