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科研戰(zhàn)神·王鐵蟲(chóng) (小有名氣)
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[交流]
【科研干貨】DNA甲基化引物設(shè)計(jì)完全攻略
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o.1 DNA甲基化原理 DNA甲基化（methylation）是一種表觀(guān)遺傳修飾，它是由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyl-transferase， DNMT）催化S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine， SAM)作為甲基供體，將DNA的CG兩個(gè)核苷酸的胞嘧啶被選擇性地添加甲基，主要形成5－甲基胞嘧啶（5-mC）（常見(jiàn)于基因的5'-CG-3'序列）和少量的N6-甲基嘌呤（N6-mA）及7－甲基鳥(niǎo)嘌呤（7-mG）結(jié)構(gòu)基因含有很多CpG 結(jié)構(gòu)， 2CpG 和2GPC 中兩個(gè)胞嘧啶的5位碳原子通常被甲基化， 且兩個(gè)甲基集團(tuán)在DNA 雙鏈大溝中呈特定三維結(jié)構(gòu)�；蚪M中60%～90%的CpG都被甲基化，未甲基化的CpG成簇地組成CpG島，位于結(jié)構(gòu)基因啟動(dòng)子的核心序列和轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)。DNA 甲基化可引起基因組中相應(yīng)區(qū)域染色質(zhì)結(jié)構(gòu)變化，使DNA 失去核酶ö限制性?xún)?nèi)切酶的切割位點(diǎn)，以及DNA 酶的敏感位點(diǎn)，使染色質(zhì)高度螺旋化，凝縮成團(tuán)，失去轉(zhuǎn)錄活性。5位C甲基化的胞嘧啶脫氨基生成胸腺嘧啶， 由此可能導(dǎo)致基因置換突變，發(fā)生堿基錯(cuò)配：T2G，如果在細(xì)胞分裂過(guò)程中不被糾正，就會(huì)誘發(fā)遺傳病或癌癥，而且，生物體甲基化的方式是穩(wěn)定的，可遺傳的。 在真核生物DNA中，5-甲基胞嘧啶是唯一存在的化學(xué)性修飾堿基。CG二核苷酸是最主要的甲基化位點(diǎn)，它在基因組中呈不均勻分布，存在高甲基化、低甲基化和非甲基化的區(qū)域，在哺乳動(dòng)物中mC約占C總量的2－7％。DNA甲基化是表觀(guān)遺傳修飾的主要方式，能在不改變DNA序列的前提下，改變遺傳表現(xiàn)。為外遺傳編碼（epigenetic code）的一部分，是一種外遺傳機(jī)制。DNA甲基化過(guò)程會(huì)使甲基添加到DNA分子上，例如在胞嘧啶環(huán)的5'碳上：這種5'方向的DNA甲基化方式可見(jiàn)於所有脊椎動(dòng)物。在人類(lèi)細(xì)胞內(nèi)，大約有1%的DNA堿基受到了甲基化。在成熟體細(xì)胞組織中，DNA甲基化一般發(fā)生于CpG雙核苷酸（CpG dinucleotide）部位；而非CpG甲基化則于胚胎干細(xì)胞中較為常見(jiàn)。植物體內(nèi)胞嘧啶的甲基化則可分為對(duì)稱(chēng)的CpG（或CpNpG），或是不對(duì)稱(chēng)的CpNpNp形式（C與G是堿基；p是磷酸根；N指的是任意的核苷酸）。特定胞嘧碇受甲基化的情形，可利用亞硫酸鹽定序（bisulfite sequencing）方式測(cè)定。DNA甲基化可能使基因沉默化，進(jìn)而使其失去功能。此外，也有一些生物體內(nèi)不存在DNA甲基化作用。 No.2 DNA甲基化引物設(shè)計(jì)原則 標(biāo)準(zhǔn)的PCR引物設(shè)計(jì)原則同樣適用于硫化測(cè)序PCR(bisulfite sequencing PCR,BSP),除了標(biāo)準(zhǔn)PCR的一些參數(shù)外,“MethPrimer”應(yīng)用3′端算法計(jì)算自身退火溫度、末端退火溫度、堿基對(duì)互補(bǔ)率、GC含量、解鏈溫度(Tm),而且還提供了上游引物和下游引物的Tm區(qū)別,以及引物中最大允許的單核苷酸重復(fù)率。因?yàn)樗蟹羌谆摹癈”都被轉(zhuǎn)換成“T”,所以“MethPrimer”中默認(rèn)的重復(fù)“T”為8個(gè),而其他堿基重復(fù)數(shù)為5個(gè)。 DNA的完全硫化是很重要的,因此應(yīng)選擇含盡可能多的非甲基化CpG的“C”區(qū)域作為源序列,設(shè)計(jì)引物。對(duì)于BSP,引物設(shè)計(jì)的原則[1]:①為了區(qū)別甲基化DNA和非甲基化DNA,引物不應(yīng)含有CpG位點(diǎn);②引物擴(kuò)增的產(chǎn)物應(yīng)包含盡可能多的CpG位點(diǎn)。 對(duì)于MSP需要設(shè)計(jì)2對(duì)引物,一對(duì)是針對(duì)于經(jīng)亞硫酸氫鹽處理的甲基化的DNA;另一對(duì)是針對(duì)于經(jīng)亞硫酸氫鹽處理的非甲基化的DNA。根據(jù)甲基化的DNA為模板的PCR擴(kuò)增甲基化的DNA;根據(jù)非甲基化的DNA為模板的PCR擴(kuò)增非甲基化的DNA。MSP引物設(shè)計(jì)的原則:①為了最大限度的區(qū)分甲基化與非甲基化,引物的3′端至少包含1個(gè)CpG位點(diǎn),我們可以自己設(shè)定CpG的“C”距3′末端的最遠(yuǎn)距離�！癕ethPrimer”中默認(rèn)值為3,即是在引物的最后3個(gè)堿基中,至少有1個(gè)是CpG的“C”。②引物序列中應(yīng)包含盡可能多的CpG位點(diǎn)。③甲基化引物和非甲基化引物序列3′端應(yīng)處于相同的CpG位點(diǎn)。如果,2對(duì)引物不在相同的CpG位點(diǎn)退火, PCR結(jié)果就不能準(zhǔn)確反映樣本DNA甲基化的情況。但是甲基化引物和非甲基化引物可跨越不同的長(zhǎng)度,在起始位點(diǎn)和長(zhǎng)度上也可以不同。一般非甲基化引物比甲基化引物長(zhǎng),因?yàn)槭躎m值限制,由于非甲基化引物中的“C”轉(zhuǎn)化成“T”,導(dǎo)致GC含量降低,從而引起Tm降低。④2套引物應(yīng)有相近的Tm值,“MethPrimer”中默認(rèn)2套引物Tm值相差不超過(guò)5℃,這種限制可使2個(gè)PCR反應(yīng)在同一PCR儀中進(jìn)行。 No.3 DNA甲基化引物設(shè)計(jì)方法 01 獲取啟動(dòng)子序列 （1）UCSC UCSC主頁(yè)（https://genome.ucsc.edu/） 圖片 點(diǎn)擊菜單欄中Tools →Gene Sorter 圖片 Genome 中選擇物種選中Human，search框中鍵入基因名: NKX2-5。 出現(xiàn)以下頁(yè)面，選擇第一個(gè)，進(jìn)入！ 圖片 圖片 選擇第一個(gè)，點(diǎn)擊sequence 圖片 可以通過(guò)以上四個(gè)選項(xiàng)獲得該基因的蛋白，mRNA，promoter以及基因組序列信息，我們這里關(guān)注的是promoter，選中包含轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游2000bp，下游0~50 bp堿基，點(diǎn)擊按鈕【get sequence】即獲得啟動(dòng)子序列。 圖片 （2）Ensemble (https://asia.ensembl.org/index.html) 圖片 選擇物種為human，鍵入基因名 NKX2-5。 圖片 選取基因 NKX2-5（Human Gene）點(diǎn)擊左側(cè)的sequence 圖片 后頁(yè)面顯示如下： 圖片 序列橙色區(qū)域的為外顯子，第一個(gè)外顯子前的序列是啟動(dòng)子，默認(rèn)為600bp，設(shè)置一下。點(diǎn)擊左側(cè)configure this page設(shè)置需要的啟動(dòng)子長(zhǎng)度，一般我們需要2000 bp （同上：選中包含轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游2000bp，下游0~50bp堿基），點(diǎn)☑ 圖片 獲得頁(yè)面橙色序列前面部分即為啟動(dòng)子序列。 圖片 02 軟件引物設(shè)計(jì) ABI公司：Methyl Primer Express v1.0引物設(shè)計(jì) 打開(kāi)軟件，在框中輸入您所關(guān)注的DNA序列 圖片 接下來(lái)，我們要進(jìn)行CpG島評(píng)估： 圖片 點(diǎn)擊 “Find CpG Islands”，將彈出下面提示框： 圖片 點(diǎn)擊“是”，則可以根據(jù)您的需要修改CpG島參數(shù)，點(diǎn)擊“否”，則按默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行CpG島評(píng)估，結(jié)果見(jiàn)下圖： 圖片 如圖所示：該序列含一個(gè)CpG島，位置為序列661bp-1190bp。點(diǎn)擊“Next”，將會(huì)把CpG Island 1作為默認(rèn)序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，當(dāng)然您也可以隨意選取您感興趣的區(qū)域進(jìn)行引物設(shè)計(jì)： 圖片 繼續(xù)點(diǎn)擊“Next”，選擇”DesignBSP Primers” 圖片 繼續(xù)點(diǎn)擊“Next”，則會(huì)彈出引物設(shè)計(jì)參數(shù)選擇的提示框，點(diǎn)擊“是”，則可以根據(jù)您的需要修改引物參數(shù)，點(diǎn)擊“否”，則按默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行引物設(shè)計(jì)： 圖片 圖片 點(diǎn)擊”O(jiān)K”,軟件會(huì)根據(jù)您設(shè)置的參數(shù)進(jìn)行引物設(shè)計(jì),結(jié)果如下圖： 圖片 圖中不同顏色箭頭分別代表上下游引物位置，點(diǎn)擊您感興趣位置的箭頭，則該箭頭會(huì)變成白色，點(diǎn)擊右下角紅色框中按鈕“>BSP Primer Report”,則會(huì)導(dǎo)出word版引物完整信息 圖片 點(diǎn)擊圖示方框中位置進(jìn)行保存即可。 文件中會(huì)包含原始DNA序列，亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化后序列和10對(duì)PCR引物信息，第一對(duì)引物信息即是您選中的白色箭頭引物，包含引物序列，退火溫度，PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度等。 03 在線(xiàn)設(shè)計(jì) 打開(kāi)MSP在線(xiàn)引物設(shè)計(jì)工具頁(yè)面：https://www.urogene.org/methprimer/ 或者他們新開(kāi)發(fā)的2.0頁(yè)面https://www.urogene.org/methprimer2/ 進(jìn)入后我們選擇第一個(gè)就好 圖片 圖片 進(jìn)入引物設(shè)計(jì)頁(yè)面后，我們把上一步得到的啟動(dòng)子區(qū)序列復(fù)制進(jìn)這個(gè)大框框里，然后勾選箭頭標(biāo)示的兩個(gè)選框，沒(méi)有其他特殊要求其他部分均按默認(rèn)選項(xiàng)設(shè)置就好。然后點(diǎn)擊submit。 圖片 新生成的頁(yè)面中會(huì)有CpG島的預(yù)測(cè)，后續(xù)如果還有其他引物要設(shè)計(jì)，可能需要這些信息。 將頁(yè)面繼續(xù)下拉即出現(xiàn)設(shè)計(jì)好的引物啦 圖片 我們通常沒(méi)有特殊要求選擇第一對(duì)引物就可以。要注意MSP需要兩對(duì)引物，分別針對(duì)被甲基化的基因序列和沒(méi)有被甲基化的。將序列復(fù)制下來(lái)加入實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，done. 當(dāng)然如果第一對(duì)引物不work，建議一次把多組引物都保存下來(lái)，以備不時(shí)之需。 |
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