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科研戰(zhàn)神·王鐵蟲 (小有名氣)
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流動(dòng)相使用必備的小細(xì)節(jié)
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流動(dòng)相，是液相色譜中用于攜帶試樣以及展開或洗脫組分的液體。在選擇和配置方面都有一定的要求和需要注意的事項(xiàng)。 流動(dòng)相的選擇： 1.流動(dòng)相應(yīng)不改變填料的任何性質(zhì)： 低交聯(lián)度的離子交換樹脂和排阻色譜填料有時(shí)遇到某些有機(jī)相會(huì)溶脹或收縮，從而改變色譜柱填床的性質(zhì)。 堿性流動(dòng)相不能用于硅膠柱系統(tǒng)。酸性流動(dòng)相不能用于氧化鋁、氧化鎂等吸附劑的柱系統(tǒng)。 2.純度： 色譜柱的壽命與大量流動(dòng)相通過有關(guān)，特別是當(dāng)溶劑所含雜質(zhì)在柱上積累時(shí)。 3.必須與檢測(cè)器匹配： 使用UV檢測(cè)器時(shí)，所用流動(dòng)相在檢測(cè)波長下應(yīng)沒有吸收，或吸收很小。當(dāng)使用示差折光檢測(cè)器時(shí)，應(yīng)選擇折光系數(shù)與樣品差別較大的溶劑作流動(dòng)相，以提高靈敏度。 4.粘度要低（應(yīng)<2cp）： 高粘度溶劑會(huì)影響溶質(zhì)的擴(kuò)散、傳質(zhì)，降低柱效，還會(huì)使柱壓降增加，使分離時(shí)間延長，最好選擇沸點(diǎn)在100℃以下的流動(dòng)相。 5.對(duì)樣品的溶解度要適宜： 如果溶解度欠佳，樣品會(huì)在柱頭沉淀，不但影響了純化分離，且會(huì)使柱子效率降低。 6.樣品易于回收： 應(yīng)選用揮發(fā)性溶劑。 配置方法： 高效液相色譜法中的流動(dòng)相主要用水性溶劑、有機(jī)溶劑或它們的混合液，水性溶劑也常用于緩沖液。 一般來說，溶劑的混合按體積比（V/V）或重量比（W/W）進(jìn)行。溶液的體積因溫度而變化，所以按重量比混合可調(diào)制再現(xiàn)性較好的混合溶劑，但由于操作較麻煩，通常多用體積比混合。 只要沒有特別標(biāo)明，就可按體積比進(jìn)行混合，但在特殊情況下，如，胺類粘度高的溶液混合時(shí)，有時(shí)用重量—體積比（W/V）的方法。 圖片 在常見的反相液相色譜中，流動(dòng)相的極性大于固定相的極性，溶質(zhì)按照疏水性的大小不同進(jìn)行分離。 極性越大或疏水性越小的溶質(zhì)，與非極性的固定相的結(jié)合越弱，相對(duì)更容易被洗脫。所以，通過改變流動(dòng)相的組成，可以有效改變分離的選擇性。 目前實(shí)驗(yàn)室最常用的反相色譜流動(dòng)相，通常以水為基礎(chǔ)，加入一定量的能與水互溶的有機(jī)極性溶劑。 圖片 在多元液相色譜系統(tǒng)中，我們往往將流動(dòng)相分為水相和有機(jī)相并通過靈活調(diào)節(jié)各個(gè)流動(dòng)相的比例來改進(jìn)分離或調(diào)整出峰時(shí)間。 流動(dòng)相是色譜純 由于液相色譜是一種相對(duì)精密程度比較高的儀器，所以流動(dòng)相的“干凈”與否，對(duì)于你能不能獲得準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)以及液相的高效運(yùn)行至關(guān)重要。所以，我們一般要求，液相色譜所用的試劑要使用高純度的專用試劑，比如說色譜純?cè)噭?br /> 圖片 色譜純是指專用于色譜分析的標(biāo)準(zhǔn)試劑，其在低波長處的透光率比較好，在色譜條件下只出現(xiàn)指定化合物的峰，不出現(xiàn)雜質(zhì)峰。當(dāng)然在要求不太嚴(yán)格時(shí)，優(yōu)級(jí)純甚至分析純的試劑也能用。 在條件允許的情況下，能用色譜純就不要用其他的！ 需要明白的是，優(yōu)級(jí)純的試劑純度也是很高的，色譜純不一定就比優(yōu)級(jí)純雜質(zhì)少，但是對(duì)于色譜分析中常用的是紫外檢測(cè)器，因此，從降低基線噪音和提高分析靈敏度上來考慮，應(yīng)該使用紫外吸收小且雜質(zhì)含量少的色譜純?cè)噭?br /> 按照國家標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)試劑中所含雜質(zhì)的多少，劃分為三個(gè)等級(jí)國對(duì)比如下： 圖片 實(shí)驗(yàn)試劑(LR：Laboratoryreagent)，又稱四級(jí)試劑。 流動(dòng)相的過濾、脫氣 由于流動(dòng)相中任何塵�；螂s質(zhì)微粒等都會(huì)磨損柱塞、密封環(huán)、缸體、單向閥等部件，同時(shí)，微粒也可能會(huì)堵塞泵口、柱頭等，使柱壓升高、柱效降低。因此要預(yù)先除去流動(dòng)相中的固體微粒，而最常用的方法就是過濾。 圖片 通常情況下，我們會(huì)采用0.22或0.45微米濾膜進(jìn)行過濾，需要注意的是，有機(jī)和無機(jī)需要分開過濾并使用對(duì)應(yīng)的濾膜。如果你用無機(jī)濾膜過濾有機(jī)溶劑，那么你就可能看到膜溶解后的樣子。 圖片 對(duì)于色譜純?cè)噭┦欠裥枰^濾這個(gè)問題，通常會(huì)存在一些爭議。理論上，色譜純?cè)诔鰪S時(shí)已經(jīng)經(jīng)過0.22微米膜過濾，是可以直接使用的。但是實(shí)際操作過程中，也有很多人為了保險(xiǎn)起見，選擇再過濾一下。 除了過濾之外，流動(dòng)相在使用前必須脫氣，以盡可能的除去溶解在流動(dòng)相中的氣體。否則這些氣體會(huì)使柱填料的性能降低，還能夠?qū)z測(cè)器的信號(hào)產(chǎn)生很大的干擾。 脫氣有多種方法，如超聲脫氣、真空脫氣、氮?dú)饷摎獾�。�?dāng)然，最常見的還是超聲脫氣。 圖片 流動(dòng)相的pH值 采用反相色譜法分離弱酸（3≤pKa≤7）或弱堿（7≤pKa≤8）樣品時(shí)，通過調(diào)節(jié)流動(dòng)相的pH值，以抑制樣品組分的解離，增加組分在固定相上的保留，并改善峰形的技術(shù)稱為反相離子抑制技術(shù)。 對(duì)于弱酸，流動(dòng)相的pH值越小，組分的K值越大，當(dāng)pH值遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于弱酸的pKa值時(shí)，弱酸主要以分子形式存在；對(duì)弱堿，情況相反。 圖片 分析弱酸樣品時(shí)，通常在流動(dòng)相中加入少量弱酸，常用50mmol/L磷酸鹽緩沖液和1%醋酸溶液；分析弱堿樣品時(shí)，通常在流動(dòng)相中加入少量弱堿，常用50mmol/L磷酸鹽緩沖液和30mmol/L三乙胺溶液。 注：流動(dòng)相中加入有機(jī)胺可以減弱堿性溶質(zhì)與殘余硅醇基的相互作用，減輕或消除峰拖尾現(xiàn)象。 使用在注意事項(xiàng)： 1.流動(dòng)相不能走空 液相色譜一旦開始測(cè)樣，我們就要留心防止溶劑瓶內(nèi)的流動(dòng)相被用完，也就是要讓濾頭一直浸沒再流動(dòng)相的液體里。否則就會(huì)造成空泵運(yùn)轉(zhuǎn)，對(duì)柱塞、缸體或密封環(huán)產(chǎn)生磨損，最終產(chǎn)生漏液。 同時(shí)，流動(dòng)相走空對(duì)色譜柱的傷害也是巨大，流動(dòng)相走空時(shí)間長的話，色譜柱內(nèi)長時(shí)間地處于沒有溶劑的狀態(tài)，就容易造成內(nèi)部填料坍塌，導(dǎo)致色譜柱報(bào)廢。 2.停泵后清洗系統(tǒng) 液相色譜使用后，一定要及時(shí)進(jìn)行清理。當(dāng)樣品測(cè)完之后，流動(dòng)相，尤其是含有緩沖液的流動(dòng)相不能保留在液相系統(tǒng)內(nèi)，尤其是在停泵過夜或更長時(shí)間不用的情況下。 如果將含有緩沖鹽的流動(dòng)相留在色譜泵內(nèi)，就可能析出鹽的微細(xì)晶體，這些晶體將損壞密封環(huán)和柱塞等。因此，必須及時(shí)清洗后，再換成合適的溶劑保存。 3.流動(dòng)相最好現(xiàn)用現(xiàn)配 在日常使用中，還需要注意的是，流動(dòng)相最好現(xiàn)用現(xiàn)配。尤其是水相溶劑，必須及時(shí)更換。對(duì)于水相溶液來說，雖然大都經(jīng)過了殺菌處理，但是細(xì)菌的生命力很頑強(qiáng)，在適當(dāng)?shù)臏囟群凸庹涨闆r下，很快就會(huì)活躍起來，不及時(shí)更換就會(huì)造成小編最近遇到的濾頭長毛事故。而有機(jī)相，雖然不會(huì)發(fā)生細(xì)菌污染，但是有機(jī)相容易發(fā)生聚合，瓶子里就會(huì)出現(xiàn)一些絮狀的聚合沉淀物。 |
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