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PCR實(shí)驗(yàn)中內(nèi)參基因的作用
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1. 判斷樣品提取是否成功。假如你提取了總RNA然后再做逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，然后再去跑PCR發(fā)現(xiàn)沒(méi)有結(jié)果，是不是表示樣品中沒(méi)有你的目的基因呢？答案是：不一定。要根據(jù)使用同一模板跑出的內(nèi)參基因的結(jié)果才可判斷。內(nèi)參基因的CT在一個(gè)合理范圍（比如20左右）的前提下，才能說(shuō)明樣品制備沒(méi)問(wèn)題，在這個(gè)前提下，做出來(lái)的結(jié)果才是可信的。 2 .用來(lái)計(jì)算目的基因的表達(dá)量。在進(jìn)行相對(duì)定量PCR時(shí)，所有的目的基因都要經(jīng)內(nèi)參基因的校正后才能進(jìn)行比較，因?yàn)槊總�(gè)樣品的提取效率都可能不同，所以不能簡(jiǎn)單的把每個(gè)PCR結(jié)果的CT值直接進(jìn)行比較，這樣是沒(méi)有意義的。只有把目的基因的表達(dá)量與內(nèi)參基因的表達(dá)量相除以后得到一個(gè)比值、然后把這個(gè)比值進(jìn)行比較，才是有意義的，而且這個(gè)比值可以量化，最終得到表達(dá)量的RQ值。 3. 與熔解曲線相對(duì)照。有時(shí)我們會(huì)發(fā)現(xiàn)染料法qPCR的熔解曲線很差，并非單峰，這時(shí)先不要確定是引物的問(wèn)題，還要先看一下內(nèi)參的CT。假如內(nèi)參的CT值很高，超過(guò)30，而目的基因的CT值很大甚至接近40，則說(shuō)明模板濃度過(guò)低，導(dǎo)致出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增的可能性增加、而目的片段含量過(guò)少。解決方法是要重新制備PCR模板。 畢合生物（www.bihebio.com）提供服務(wù)內(nèi)容：分子生物學(xué)、免疫, 重組蛋白及ELISA相關(guān)、活性小分子化合物、高端化學(xué)、材料化學(xué)、細(xì)胞資源庫(kù)與培養(yǎng)相關(guān)、生命科學(xué)、天然產(chǎn)物 |
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