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超困困狗g新蟲 (小有名氣)
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干貨分享 ｜PCR和凝膠電泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果常見問題及原因分析
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為了排除某些因素對(duì)PCR結(jié)果的影響，PCR實(shí)驗(yàn)需要對(duì)照實(shí)驗(yàn)。PCR的陽(yáng)性對(duì)照是Marker，推測(cè)PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度，判斷PCR產(chǎn)物是否是目的片段。PCR的陰性對(duì)照是PCR的空白管，除了模板不加之外，其成分與其他管一樣，證明沒有其他模板污染。 由于目前所用的PCR儀器自動(dòng)化程度較低，操作步驟較為繁雜，人為因素大，這就不可避免地會(huì)出現(xiàn)不同程度的誤差。輕微的污染、加量的誤差等均可導(dǎo)致結(jié)果較大的差異，甚至陽(yáng)性和陰性出現(xiàn)兩種迥然不同的結(jié)果。在分析測(cè)定工作中系統(tǒng)誤差產(chǎn)生的原因主要有：方法誤差、儀器誤差、人員誤差、環(huán)境誤差、試劑誤差等。本期我給大家搜集了一些平時(shí)經(jīng)常性遇到的一些問題，希望對(duì)大家有所幫助。 要分析遇到的問題，除了考慮必要的儀器外，需要明確PCR（聚合酶鏈反應(yīng)）的基本要素： 引物：這些是特別設(shè)計(jì)的短DNA序列，作為DNA合成的起始點(diǎn)，針對(duì)目標(biāo)DNA的兩端進(jìn)行互補(bǔ)配對(duì)。引物長(zhǎng)度一般在20到30個(gè)核苷酸之間。 DNA聚合酶：以Taq聚合酶為代表的酶類，負(fù)責(zé)新DNA鏈的合成。Taq聚合酶能夠在引物附著的地方開始工作，通過逐一添加核苷酸來延長(zhǎng)DNA鏈。這種聚合酶能夠耐受PCR過程中必需的高溫條件，這是因?yàn)樗鼇碓从谀茉跓崴h(huán)境中生存的微生物。 脫氧核苷酸三磷酸（dNTPs）：這些分子提供了新DNA鏈合成的原料，包括四種類型：dATP、dCTP、dGTP和dTTP。在PCR過程中，Taq聚合酶利用這些dNTPs來逐步構(gòu)建新的DNA鏈。 目標(biāo)DNA提�。簩�(shí)驗(yàn)開始之前，首先需要從樣本中提取出所要研究的DNA片段。 緩沖溶液：提供適宜的反應(yīng)環(huán)境，確保PCR反應(yīng)能夠有效進(jìn)行。 氯化鎂（MgCl2）：作為Taq聚合酶活性的輔助因子，對(duì)于酶的功能至關(guān)重要。 1.耗材選擇不當(dāng)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成很大的影響 PCR耗材一般都是聚丙烯（PP）材質(zhì)，因其為生物學(xué)惰性材料，表面不易于粘附生物分子，且有著良好的化學(xué)耐性，及溫度耐受性（可121℃高壓滅菌，也可以承受熱循環(huán)過程中的溫度變化）。這些材料通常會(huì)與試劑或者樣品直接接觸，因而在生產(chǎn)制備過程中需要選用高質(zhì)量的材料和良好的加工工藝。 PCR管的體積大多數(shù)都可以滿足PCR反應(yīng)要求。但是在滿足實(shí)驗(yàn)要求的基礎(chǔ)上，優(yōu)先推薦選用低容管。因?yàn)榈腿莘磻?yīng)管有著較小的上方空間，可提高熱傳導(dǎo)率并降低蒸發(fā)。而且在加樣時(shí)，需要避免加樣過量或過少。過量會(huì)導(dǎo)致熱傳導(dǎo)率下降，溢出及交叉污染，而加樣過少可能會(huì)造成樣品蒸發(fā)損失。 2.假陰性（無擴(kuò)增產(chǎn)物）——現(xiàn)象：陽(yáng)性對(duì)照有條帶，而樣品則無 原因：模板含有抑制物，含量低；緩沖液（Buffer）對(duì)樣品不合適；引物設(shè)計(jì)不當(dāng)或者發(fā)生降解；反應(yīng)條件：退火溫度太高，延伸時(shí)間太短。 對(duì)策：純化模板或者使用試劑盒提取模板DNA或加大模板的用量；更換Buffer或調(diào)整濃度；重新設(shè)計(jì)引物（避免鏈間二聚體和鏈內(nèi)二級(jí)結(jié)構(gòu)）或者換一管新引物；降低退火溫度、延長(zhǎng)延伸時(shí)間。 3.非特異性擴(kuò)增 ——條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致或者非特異性擴(kuò)增帶 原因：引物的特異性不強(qiáng)、提取模板DNA中可能會(huì)有非靶基因性同源序列；模板或引物濃度過高；酶量過多；Mg2+濃度偏高；退火溫度偏低；循環(huán)次數(shù)過多。 對(duì)策：重新設(shè)計(jì)引物；適當(dāng)降低模板或引物濃度；適當(dāng)減少酶量；降低鎂離子濃度；適當(dāng)提高退火溫度則減少與同源性非靶DNA的互補(bǔ)程度；減少循環(huán)次數(shù)。 4.拖尾——產(chǎn)物在凝膠上呈模糊不清狀態(tài)（彌散） 原因：模板不純；引物濃度不夠優(yōu)化；Buffer不合適；退火溫度偏低；.酶量過多；dNTP、Mg2+濃度偏高；循環(huán)次數(shù)過多。 對(duì)策：純化模板；對(duì)引物進(jìn)行梯度稀釋；更換Buffer；適當(dāng)提高退火溫度；適量用酶；適當(dāng)降低dNTP和鎂離子的濃度；減少循環(huán)次數(shù)。 5.假陽(yáng)性——空白對(duì)照出現(xiàn)目的擴(kuò)增產(chǎn)物 原因：出現(xiàn)假陽(yáng)性最大的可能性是污染有非樣品性靶基因，特別是進(jìn)行大量檢測(cè)或經(jīng)常性針對(duì)同一種靶基因的擴(kuò)增試驗(yàn)時(shí)，如稍不慎重，就會(huì)導(dǎo)致樣品間的交叉污染及實(shí)驗(yàn)室的“隨帶性”污染。出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果的另一種可能是樣品中存在有靶基因的同源序列，這在基因組DNA中擴(kuò)增特異片段時(shí)應(yīng)特別注意，對(duì)于樣品間的交叉污染，實(shí)驗(yàn)室的隨帶污染、避免假陽(yáng)性關(guān)鍵在于提高警惕慎重操作。 對(duì)策：操作時(shí)應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外；除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及加樣槍頭等均應(yīng)一次性使用；各種試劑最好先進(jìn)行分裝，然后低溫貯存 。 |
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