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干貨分享 | 質(zhì)粒載體
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載體 在Cohen和Boyer的實驗中，兩種質(zhì)粒都能在E. coli中復(fù)制。因此，這兩種質(zhì)粒都可以作為載體，使重組DNA得以復(fù)制。所有基因克隆實驗都需要這樣的載體，我們稱之為載體（Vector），但典型的基因克隆實驗只涉及一個載體，以及一個依賴于載體進行復(fù)制的外源DNA片段。外源DNA沒有復(fù)制起點，即DNA復(fù)制開始的地方，因此除非將其放入具有復(fù)制起點的載體中，否則它無法復(fù)制。自20世紀(jì)70年代中期以來，已經(jīng)開發(fā)了許多載體；這些載體分為兩大類：質(zhì)粒（plasmid）和噬菌體（phage）。無論載體的性質(zhì)如何，都必須通過轉(zhuǎn)化將重組DNA引入細(xì)菌細(xì)胞。傳統(tǒng)的做法是將細(xì)胞在濃縮的鈣鹽溶液中孵育，使細(xì)胞膜變得通透，然后將這些通透的細(xì)胞與DNA混合，以使DNA進入細(xì)胞�；蛘�，人們可以使用高電壓將DNA壓入細(xì)胞，這個過程稱為電轉(zhuǎn)化（electroperation）。 質(zhì)粒載體 在克隆時代的早期，Boyer和他的同事們開發(fā)了一系列非常受歡迎的載體，稱為pBR質(zhì)粒系列。如今，除了pBR質(zhì)粒之外，人們還可以選擇許多其他的質(zhì)�？寺≥d體。一個有用，但稍顯過時的質(zhì)粒系列是pUC系列。這些質(zhì)�；趐BR322開發(fā)的，其大約40%的DNA已被刪除。此外，pUC載體具有許多限制酶切割位點，這些位點集中在一個稱為多克隆位點（MCS）的小區(qū)域內(nèi)。pUC載體含有一個氨芐青霉素抗性基因，以允許選擇接收質(zhì)�？截惖募�(xì)菌。此外，它們具有在篩選含有重組DNA的克隆時提供便利的遺傳元件。 pUC載體的多克隆位點位于編碼β-半乳糖苷酶氨基末端部分（α-肽）的DNA序列（稱為lacZ'）內(nèi)。與pUC載體一起使用的宿主細(xì)菌攜帶編碼β-半乳糖苷酶羧基末端部分（β-肽）的基因片段。僅憑這些部分基因產(chǎn)生的β-半乳糖苷酶片段沒有活性。但它們可以在體內(nèi)通過所謂的α-互補來互補。換句話說，這兩個部分基因產(chǎn)物可以結(jié)合形成具有活性的β-半乳糖苷酶。因此，當(dāng)pUC18自身轉(zhuǎn)化攜帶部分β-半乳糖苷酶基因的細(xì)菌細(xì)胞時，會產(chǎn)生活性β-半乳糖苷酶。如果將這些克隆接種在含有β-半乳糖苷酶指示劑的培養(yǎng)基上，含有pUC質(zhì)粒的菌落將變色。例如，指示劑X-gal是一種合成、無色的半乳糖苷；當(dāng)β-半乳糖苷酶分解X-gal時，它會釋放出半乳糖和一種可以將細(xì)菌菌落染成藍色的靛藍染料。 另一方面，通過將一個插入片段放入多克隆位點，通常會中斷質(zhì)粒的部分β-半乳糖苷酶基因。它無法再產(chǎn)生與宿主細(xì)胞的β-半乳糖苷酶片段互補的產(chǎn)物，因此X-gal保持無色。因此，挑選帶有插入片段的克隆很簡單。它們是白色的；其余的都是藍色的。注意這是一個一步的過程。同時尋找具有以下兩個特征的克隆：（1）在氨芐青霉素上生長；（2）在X-gal存在時呈白色。多克隆位點已經(jīng)精心構(gòu)建，以保持β-半乳糖苷酶的可讀框。因此，即使基因被18個密碼子中斷，仍然會產(chǎn)生功能性蛋白。但是，大型插入片段的進一步中斷通常會破壞基因的功能。 即使有顏色篩選，pUC克隆也可能產(chǎn)生假陽性，即沒有插入片段的白色菌落。如果載體的末端在連接到插入片段之前被核酸酶“啃咬”了一點，然后這些稍微降解的載體在連接步驟中簡單地閉合，那么lacZ’基因可能已經(jīng)改變得足以產(chǎn)生白色菌落。這強調(diào)了使用純DNA和不含核酸酶活性的酶的重要性。 載體自連接的現(xiàn)象在我們使用沒有顏色篩選的載體時可能成為一個更大的問題，因為這樣更難以區(qū)分帶有插入片段的菌落和沒有插入片段的菌落。即使在使用pUC和相關(guān)載體時，我們也希望盡量減少載體自身連接的情況。一個好的方法是使用堿性磷酸酶處理載體，這會去除連接所需的5’-磷酸基團。沒有這些磷酸基團，載體就無法自身連接，但仍可以與保留其5’-磷酸基團的插入片段連接。上圖說明了這個過程。請注意，由于只有插入片段具有磷酸基團，連接產(chǎn)物中會留下兩個缺口（未形成的磷酸二酯鍵）。這些缺口不是問題；一旦連接的DNA進入細(xì)菌細(xì)胞，它們將被DNA連接酶在體內(nèi)封閉。多克隆位點還允許使用兩種不同的限制酶（例如EcoRI和BamHI）對其進行切割，然后克隆一個具有一個EcoRI末端和一個BamHI末端的DNA片段。這稱為定向克隆，因為插入的DNA只能以一個方向放入載體中。（插入的EcoRI和BamHI末端必須與載體中的對應(yīng)末端匹配。）知道插入片段的方向具有某些好處，我們將在本章后面探討這些好處。定向克隆還具有防止載體簡單地自身重新連接的優(yōu)勢，因為其兩個限制酶切割位點是不兼容的�，F(xiàn)在有比這些更方便的載體可用。 總結(jié) 第一代質(zhì)�？寺≥d體包括pBR322和pUC質(zhì)粒。后者具有氨芐青霉素抗性基因和一個中斷部分β-半乳糖苷酶基因的多克隆位點。通過篩選對氨芐青霉素有抗性的克隆，這些克隆不產(chǎn)生活性β-半乳糖苷酶，因此不會使指示劑X-gal變藍。多克隆位點還使得進行定向克隆到兩個不同的限制酶切割位點變得方便。 |
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