版塊導(dǎo)航: 正在加載中...

登錄注冊

應(yīng)《網(wǎng)絡(luò)安全法》要求，自2017年10月1日起，未進(jìn)行實(shí)名認(rèn)證將不得使用互聯(lián)網(wǎng)跟帖服務(wù)。為保障您的帳號能夠正常使用，請盡快對帳號進(jìn)行手機(jī)號驗(yàn)證，感謝您的理解與支持！

24小時(shí)熱門版塊排行榜

返回列表

科研顧問_Gu

新蟲 (小有名氣)

應(yīng)助: 0 (幼兒園)
金幣: -124.8
帖子: 237
在線: 17.9小時(shí)
蟲號: 35203136
注冊: 2024-03-27
性別: GG
專業(yè): 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)

[交流] 實(shí)驗(yàn)干貨 | 細(xì)胞復(fù)蘇tips 已有1人參與

平時(shí)研究用的細(xì)胞，有需要冷凍保存。冷凍的過程稱為凍存，和凍存對應(yīng)的過程，稱為復(fù)蘇，通俗地說就是把凍上的細(xì)胞化開。

細(xì)胞復(fù)蘇是一簡單的試驗(yàn)操作，但操作中有許多需要注意的事項(xiàng)，在實(shí)驗(yàn)操作中注意細(xì)小問題，才能使復(fù)蘇后的細(xì)胞狀態(tài)保持良好。

下面小編就和大家分享細(xì)胞復(fù)蘇的“避坑指南”。

細(xì)胞復(fù)蘇的基本原則

快速融化：細(xì)胞復(fù)蘇過程升溫要快，防止在解凍過程中水分進(jìn)入細(xì)胞，形成冰晶，影響細(xì)胞存活。

在復(fù)蘇時(shí)，需要快速升溫，在 1-2 min 內(nèi)融化并稀釋，這時(shí)細(xì)胞內(nèi)外還來不及形成較大的冰晶，也不會(huì)使細(xì)胞長時(shí)間暴露在高濃度的電解質(zhì)溶液中，從而避免細(xì)胞損傷，提高細(xì)胞存活率。

避免溫度變化：在復(fù)蘇過程中，應(yīng)盡量避免溫度的劇烈變化，以免對細(xì)胞造成額外的壓力。

細(xì)胞復(fù)蘇的實(shí)驗(yàn)步驟及注意事項(xiàng)

（1）提前從液氮罐中取出需要解凍的凍存管，放于-80 ℃冰箱（為了避免解凍時(shí)凍存管中的氣溫急劇上升，溫差過大導(dǎo)致的爆炸），讓凍存管中的液氮揮發(fā)。

注意：從液氮中凍存細(xì)胞時(shí)，要佩戴護(hù)目鏡和防凍手套，謹(jǐn)防凍傷及凍存管爆炸！

（2）凍存管取出后，以最快速度放入37℃恒溫水浴鍋中。如果儲存裝置和解凍裝置相隔較遠(yuǎn)，可使用裝有干冰的隔熱容器臨時(shí)保存和運(yùn)送細(xì)胞。

細(xì)胞放入水浴中復(fù)蘇時(shí)，注意用鑷子夾住細(xì)胞凍存管并在水浴中不時(shí)晃動(dòng)，使其受熱均勻，且速度越快越好，這樣可以可以避免復(fù)蘇過程中細(xì)胞液中有冰晶的出現(xiàn)�？焖偕郎乜梢允贡а杆偃诨苊鈧�(xì)胞，因此，必須在1-2min內(nèi)使凍存液完全融化。

另外，凍存管管口不能接觸到水浴鍋里的液體，避免造成污染。水浴鍋中的無菌水也要定期更換。

什么時(shí)候停止解凍？

通常建議凍存管融化至只剩約2毫米直徑的冰晶時(shí)，即可停止水浴，繼續(xù)晃動(dòng)至冰晶融化。此時(shí)復(fù)蘇的時(shí)間剛好，避免復(fù)蘇過頭。（升溫至室溫或更高溫度會(huì)增加冷凍保護(hù)劑的細(xì)胞毒性，這會(huì)極大影響細(xì)胞活力。）

（3）完全融化后，馬上擦干并用75％酒精擦拭冷凍管外部進(jìn)行消毒。然后在無菌環(huán)境下，用移液管吸取5ml預(yù)熱的完全培養(yǎng)基加入15mL無菌離心管中，再吸取凍存管里的細(xì)胞懸液加入離心管中。

注意：

◆ 解凍后應(yīng)盡快稀釋，以減少 DMSO 的細(xì)胞毒性。

◆ 此時(shí)細(xì)胞比較脆弱，細(xì)胞膜表面還未完全恢復(fù)，劇烈的吹打會(huì)造成細(xì)胞活率下降。因此，需要以輕柔的方式稀釋細(xì)胞凍存懸液。輕柔顛倒混勻，充分稀釋凍存液，有條件可以靜置1分鐘，使細(xì)胞恢復(fù)滲透壓，再進(jìn)行下一步操作。

（4）根據(jù)細(xì)胞類型選擇合適的離心速度，低速離心5min，吸掉上清液，加入2-3mL預(yù)熱的完全培養(yǎng)基，用移液管輕輕吹打均勻，保證細(xì)胞完全重懸。

注意：離心的目的有兩個(gè)，去除DMSO，去除死細(xì)胞，這個(gè)是標(biāo)準(zhǔn)流程。但對一般人來說，把握不好離心轉(zhuǎn)速和時(shí)間，轉(zhuǎn)速不夠活細(xì)胞沉底的少，細(xì)胞就全被扔掉了，轉(zhuǎn)速過高活細(xì)胞受壓過大，會(huì)導(dǎo)致死亡。推薦250 g離心4 min。

（5）吹打好后，用完全培養(yǎng)基適當(dāng)稀釋，然后將重懸的細(xì)胞全部移入新的培養(yǎng)皿或者培養(yǎng)瓶中搖晃均勻。

（6）最后放入37℃恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱，依據(jù)細(xì)胞狀態(tài)，在細(xì)胞貼壁后或 24 h 后，更換一次培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)，觀察生長情況。若細(xì)胞密度較高，及時(shí)傳代。

注意：細(xì)胞復(fù)蘇的操作在4℃冰盒中進(jìn)行，以減少冷凍保護(hù)劑對細(xì)胞的毒性。

（來源于互聯(lián)網(wǎng)）

常見的問題

（1）細(xì)胞復(fù)蘇后，細(xì)胞數(shù)量很少

可能得原因：細(xì)胞凍存前活細(xì)胞少，狀態(tài)不佳；細(xì)胞解凍速度過慢；細(xì)胞凍存懸液在常溫下時(shí)間太久；未充分稀釋凍存液；離心速度不恰當(dāng)。

對策：

◆ 確保凍存前細(xì)胞狀態(tài)良好，活細(xì)胞比例高。

◆ 加快解凍速度，盡量減少在常溫下的放置時(shí)間。

◆ 確保凍存液充分稀釋，避免對細(xì)胞造成損傷。

◆ 調(diào)整離心速度，找到最適合細(xì)胞的離心條件。

（2）細(xì)胞復(fù)蘇后，很多難以貼壁

對策：

◆ 檢查緩凍快融操作是否規(guī)范，避免操作不當(dāng)導(dǎo)致的損傷。

◆ 確認(rèn)凍存前細(xì)胞的密度和活率是否適宜。

◆ 控制好消化時(shí)間，避免過長導(dǎo)致細(xì)胞貼壁能力下降。

（3）細(xì)胞貼壁了，卻長不起來

對策：

◆ 調(diào)整細(xì)胞密度，嘗試將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到較小的培養(yǎng)器皿中，促進(jìn)細(xì)胞間的相互作用。

◆ 給予細(xì)胞足夠的時(shí)間來適應(yīng)培養(yǎng)環(huán)境，有些細(xì)胞復(fù)蘇后需要一段時(shí)間才能開始生長。

◆ 確保凍存前細(xì)胞狀態(tài)良好，避免凍存前細(xì)胞已處于凋亡狀態(tài)。

此外，還需注意培養(yǎng)環(huán)境的無菌操作，定期檢查培養(yǎng)基的成分和pH值，以及確保足夠的營養(yǎng)供給和適宜的氣體環(huán)境（如CO2濃度）。在處理細(xì)胞時(shí)，溫和操作，避免造成機(jī)械損傷。

細(xì)胞培養(yǎng)是一門實(shí)踐性很強(qiáng)的技術(shù)，需要在實(shí)踐中不斷學(xué)習(xí)和總結(jié)經(jīng)驗(yàn)，希望這些建議對您有所幫助。

回復(fù)此樓

» 收錄本帖的淘帖專輯推薦

cell

» 猜你喜歡

不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)中的趣事：實(shí)驗(yàn)器材的 “烏龍” 已經(jīng)有0人回復(fù)
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)中的趣事：和實(shí)驗(yàn)材料的 “斗智斗勇” 已經(jīng)有0人回復(fù)
化學(xué)工程及工業(yè)化學(xué)論文潤色/翻譯怎么收費(fèi)? 已經(jīng)有274人回復(fù)
蛋白質(zhì)檢測：精準(zhǔn)分析，解鎖生物分子的密碼已經(jīng)有0人回復(fù)
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之小鼠實(shí)驗(yàn)：嚴(yán)謹(jǐn)設(shè)計(jì)，解析生命機(jī)制的重要載體已經(jīng)有0人回復(fù)
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之重金屬檢測：精準(zhǔn)篩查，守護(hù)健康與環(huán)境的防線已經(jīng)有0人回復(fù)
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之“蛙測重金屬我背鍋三千” 已經(jīng)有0人回復(fù)
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之“鼠逃三次我發(fā)三篇SCI” 已經(jīng)有0人回復(fù)
納米粒度分析已經(jīng)有3人回復(fù)
林科院林化所招收材料與化工專業(yè)碩士，坐標(biāo)南京已經(jīng)有0人回復(fù)

1樓 2024-05-10 08:40:03

已閱回復(fù)此樓關(guān)注TA 給TA發(fā)消息送TA紅花 TA的回帖

看海的snoopy

金蟲 (正式寫手)

應(yīng)助: 8 (幼兒園)
金幣: 1.1
帖子: 320
在線: 24.8小時(shí)
蟲號: 2127433
注冊: 2012-11-14
性別: GG
專業(yè): 生物化學(xué)

學(xué)習(xí)了

回復(fù)此樓

2樓2024-05-11 10:12:27

已閱回復(fù)此樓關(guān)注TA 給TA發(fā)消息送TA紅花 TA的回帖

相關(guān)版塊跳轉(zhuǎn) 我要訂閱樓主科研顧問_Gu 的主題更新