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干貨分享 | Q-PCR干粉引物，如何溶解？保存溫度和時間是多少？
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現(xiàn)代科研基本離不開分子實驗，分子實驗又基本離不開PCR，PCR肯定離不開引物了，今天給小伙伴們討論收到引物的處理問題。 QPCR 干粉引物溶解稀釋的一般方法如下： 收到引物后，在開啟離心管蓋前，在3000-4000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速下離心1分鐘，以防開蓋時引物干粉散失。因為引物在干燥過程中，寡核苷酸在EP管底部形成白色片狀沉淀。鑒于運輸過程中沉淀會飄起，在打開管蓋之前進行簡短離心這一步驟至關(guān)重要。 引物保存在高濃度的狀況下比較穩(wěn)定。如果對實驗的重復性要求較高，合成的 OD 數(shù)較大，建議分裝，避免反復凍融。 引物一般配制成10-100umol/l。 引物的濃度可以通過以下公式計算：引物終濃度（μM）=所需引物量（μg）/引物分子量（g/mol）/反應體積（L）�？梢愿鶕�(jù)引物的OD值和分子量來計算需要加入多少液體才達到100μM的濃度，但沒必要學這個，一般公司都會直接給算好，在標簽處標明需要加入多少液體溶解以達到100μM的濃度。 用哪種溶劑溶解引物？ 如果需要稀釋引物，可以使用滅菌的去離子水或TE緩沖液（pH7.4-8.0）作為溶劑。其中，TE緩沖液比較穩(wěn)定，能提供穩(wěn)定的pH環(huán)境，適合于保存引物（以及質(zhì)�；蚧蚪MDNA），但也有人認為，TE中的EDTA分子會影響后續(xù)PCR的效率。 引物的保存溫度和時間有什么限制？ 未溶解的引物在-20℃下可保存至少1年，溶解后的引物在-20℃下避免反復凍融，可以保存至少半年以上。如果對實驗的重復性要求較高，合成的OD值較大，建議將溶解好的引物事先稀釋為100μmol/L的儲存液，分裝數(shù)份保存于-20℃冰箱。使用前，將濃溶液稀釋成工作液（10pmol/μl或20pmol/μl）后進行實驗。 |
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