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科研戰(zhàn)神·王鐵蟲 (小有名氣)
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終極攻略 | WB內(nèi)參的選擇
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內(nèi)參即是內(nèi)部參照（Internal Control），對(duì)于哺乳動(dòng)物細(xì)胞來說一般是指由管家基因編碼表達(dá)的蛋白（Housekeeping Proteins），它們?cè)诟鹘M織和細(xì)胞中的表達(dá)相對(duì)恒定，在檢測(cè)蛋白的表達(dá)水平變化時(shí)常用它來做參照物。 一 為什么要使用內(nèi)參呢？ Western blot除了能證明某樣品含有某種蛋白之外，其最為重要的作用是比較不同條件下或者不同組織中，目的蛋白表達(dá)量的相對(duì)多少。即為蛋白表達(dá)水平最直接的證據(jù)。要衡量蛋白的表達(dá)水平，前提條件就是等量的上樣量。 然而如果僅將蛋白濃度測(cè)定作為規(guī)范需相互比較的各種樣品間上樣量等同的唯一方法，顯然是不可取的。 首先各種蛋白質(zhì)濃度定量方法都存在局限性，不能完全準(zhǔn)確的確定各種樣品的蛋白濃度。如UV法直接定量，適合測(cè)試較純凈、成分相對(duì)單一的蛋白質(zhì)，相對(duì)于比色法來說，操作簡(jiǎn)單，但是容易受到平行物質(zhì)如DNA的干擾，且敏感度低，要求蛋白的濃度較高。比色法測(cè)定蛋白濃度一般有BCA、Bradford、Lowry等幾種方法。BCA法與Lowry法都容易受到蛋白質(zhì)之間以及去污劑的干擾。Bradford法敏感度最高，且與一些列干擾Lowry、BCA反應(yīng)的還原劑（如DTT、巰基乙醇）相溶，但是對(duì)去污劑依然是敏感的，其最主要的缺點(diǎn)是不同的標(biāo)準(zhǔn)品會(huì)導(dǎo)致同一樣品的結(jié)果差異較大，無可比性。另外，蛋白質(zhì)定量以后進(jìn)行電泳時(shí)需要等量上樣，此步驟也存在操作誤差。在Western Blot實(shí)驗(yàn)時(shí)使用內(nèi)參，即可簡(jiǎn)便地對(duì)定量和上樣步驟產(chǎn)生的誤差進(jìn)行校正。 在Western Blot中使用內(nèi)參其實(shí)就是在WB過程中另外用內(nèi)參對(duì)應(yīng)的抗體檢測(cè)內(nèi)參，這樣在檢測(cè)目的產(chǎn)物的同時(shí)可以檢測(cè)內(nèi)參的表達(dá)，由于內(nèi)參在各組織和細(xì)胞中的表達(dá)相對(duì)恒定，借助檢測(cè)每個(gè)樣品內(nèi)參的量就可以用于校正上樣誤差，這樣半定量的結(jié)果才更為可信。此外使用內(nèi)參可以作為空白對(duì)照，檢測(cè)蛋白轉(zhuǎn)膜情況是否完全、整個(gè)Western Blot顯色或者發(fā)光體系是否正常。 二 如何選擇合適的內(nèi)參呢？ 有些人提取蛋白會(huì)選擇胞漿、胞核分開提取，不提取總蛋白。β-actin在胞漿中表達(dá)高效穩(wěn)定，而總蛋白主要成分就是胞漿蛋白，所以β-actin可以作為總蛋白的內(nèi)參。理論上細(xì)胞核內(nèi)不表達(dá)β-actin，所以不能用于核蛋白內(nèi)參。同理，細(xì)胞核內(nèi)的蛋白用于做總蛋白內(nèi)參，自然也不合理，內(nèi)參自當(dāng)選擇與目的蛋白表達(dá)部位相同的蛋白才能有說服力。 而實(shí)際情況中，無論什么試劑盒，都不可能完全將胞漿、胞核蛋白完全分離開，提取時(shí)總會(huì)有交叉污染。即提取的核蛋白肯定會(huì)有β-actin，而胞漿蛋白也會(huì)有核蛋白的存在，所以你用兩種蛋白做內(nèi)參都能有結(jié)果，只是有的科學(xué)合理，有的不科學(xué)，沒有說服力。 此外很多公司的內(nèi)參抗體是用抗原片段制備的，不同的公司選擇的片段不一樣。以最常用的β-actin為例，有的公司選擇N端，有的選擇C端。選用N端的抗體均不能檢測(cè)心肌和橫紋肌中的actin條帶。選用C端的抗體可以在肌肉細(xì)胞中檢測(cè)到actin陽(yáng)性信號(hào)。有時(shí)候在實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)內(nèi)參時(shí)產(chǎn)生“組織特異性”，就是由于抗體選擇不對(duì)造成的。 那么應(yīng)該如何選擇合適的內(nèi)參呢，一般遵循以下原則： 1 樣本種屬來源 首先要考慮的就是實(shí)驗(yàn)樣本來源于什么物種。哺乳動(dòng)物的組織或者細(xì)胞樣本，通常選擇β-actin、Tubulin、GAPDH、Lamin B、PCNA、Na+/K+-ATPase等。植物來源實(shí)驗(yàn)樣本則可以選擇Plant actin、Rubisco等。其他來源樣本研究較少，所以就應(yīng)該參照文獻(xiàn)報(bào)道，選擇合適的蛋白作為內(nèi)參。 2 目的蛋白分子量 選擇內(nèi)參抗體時(shí)，應(yīng)該考慮目的蛋白分子量的大小。通常應(yīng)該保證目的蛋白與內(nèi)參蛋白分子量相差5KD以上。比如檢測(cè)目的蛋白分子量為45KD，此時(shí)不適宜選擇β-actin（42KD）作為內(nèi)參，可以考慮選擇GAPDH（36KD）作為內(nèi)參。 3 目的蛋白表達(dá)部位 a、胞漿和全細(xì)胞蛋白：β-actin（43KD）、GAPDH（37KD）、Tubulin（55KD）等； b、胞核蛋白：PCNA（29KD）、Histone H3（17KD）等； c、核膜蛋白：Lamin B（66KD）等； d、胞膜蛋白：Na+/K+-ATPase（120KD）等； e、線粒體蛋白：COX IV（17KD）、VDAC1（30KD）等。 4 實(shí)際的實(shí)驗(yàn)環(huán)境 有些細(xì)胞在某些條件下內(nèi)參表達(dá)會(huì)出現(xiàn)異常，使其不適合做內(nèi)參。比如某些細(xì)胞中，由于組織缺氧、糖尿病等因素會(huì)導(dǎo)致GAPDH的表達(dá)增高，不適合做內(nèi)參。在凋亡實(shí)驗(yàn)時(shí)，Lamin等也不適合作為內(nèi)參。在加入抗癌和抗真菌藥物時(shí)，Tubulin的表達(dá)易受影響，不適合作為內(nèi)參。Lamin B不適合作為胚胎干細(xì)胞的內(nèi)參，而PCNA不適合作為非增殖細(xì)胞的內(nèi)參等。因此設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案的時(shí)候應(yīng)該考慮這些因素并查詢相應(yīng)文獻(xiàn)，在實(shí)驗(yàn)過程中也應(yīng)該注意如果內(nèi)參表達(dá)出現(xiàn)異常，應(yīng)考慮這方面因素。 5 不同的組織特異性 actin 即肌動(dòng)蛋白，是細(xì)胞的一種重要骨架蛋白。actin 大致可分為六種，其中四種是不同肌肉組織特異性的，包括alpha-skeletal muscle actin、alpha-cardiac muscle actin、alpha-smooth muscle actin和gamma-smooth muscle actin，其余兩種廣泛分布于各種組織中，包括beta-actin（β-non-muscle）和gamma-non-muscle actin。這些不同的亞型組織分布是不一樣的，在肌肉組織中beta-actin分布就很少，心肌主要是alpha-cardiac muscle actin。因此不同的組織本來就應(yīng)該選擇不同的內(nèi)參，不能一概而論。 三 Western Blot中怎樣使用內(nèi)參呢？ 在Western Blot實(shí)驗(yàn)過程中使用的內(nèi)參的方法有： 超級(jí)簡(jiǎn)便的標(biāo)記內(nèi)參使用法：只要在二抗孵育時(shí)加入HRP標(biāo)記內(nèi)參抗體（一抗孵育時(shí)不加抗體，即HRP直接標(biāo)記于內(nèi)參一抗上），按照正常操作即可。 普通內(nèi)參：當(dāng)目的蛋白的分子量大小與選用的內(nèi)參蛋白分子量相差不大時(shí)，可以先進(jìn)行目的蛋白的抗體溫育顯色和檢測(cè)。然后使用Strip緩沖液洗掉膜上的抗體，重新進(jìn)行內(nèi)參蛋白的抗體溫育、顯色檢測(cè)。 當(dāng)目的蛋白的分子量大小與選用的內(nèi)參蛋白分子量大小相差比較明顯情況下，可以在轉(zhuǎn)膜后預(yù)染，根據(jù)蛋白質(zhì)Marker的大小將膜剪為大分子量和小分子量?jī)刹糠郑箖?nèi)參蛋白與目的蛋白分開。然后兩塊膜分別與內(nèi)參蛋白抗體以及目的蛋白抗體進(jìn)行溫育，二抗溫育以及顯色。 |
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