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科研實驗_研實新蟲 (小有名氣)
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[交流]
關(guān)于質(zhì)粒提取的那些事兒
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雖然質(zhì)粒提取是非常簡單的操作，但是很多人對于其中的原理并非清楚。只知道在使用試劑盒的時候，加入溶液1，2，3，不知道溶液中含有的具體成分，也不清楚，每一種成分所起到的作用。 細胞中存在蛋白質(zhì)，chromsomal DNA，plasmid DNA，RNA，我們的目的是把質(zhì)粒DNA給提取出來，而且不能摻雜其他的生物大分子。蛋白質(zhì)可以讓它沉淀，RNA可以加入RNase降解，可以看出，質(zhì)粒提取最關(guān)鍵的問題是如何把chromosomal DNA和plasmid DNA給區(qū)分開來。 細菌沒有細胞核，只有一個擬核（nucleoid），chromosomal DNA是環(huán)狀的，但是并非裸露的，上面結(jié)合有多種NAPs(nucleoid-associated proteins)。NAPs和基因轉(zhuǎn)錄活性可以改變擬核的形態(tài)結(jié)構(gòu)。相對之下，plasmid DNA就要簡單很多，游離于細胞質(zhì)中，以共價閉環(huán)cccDNA（convalently closed circular DNA ）的形態(tài)存在。 圖片 圖1 細菌擬核相關(guān)結(jié)構(gòu) 質(zhì)粒提取主要包括三個步驟：菌體擴繁、菌體裂解釋放質(zhì)粒DNA，和質(zhì)粒DNA的分離與純化。質(zhì)粒提取主要有堿裂解法，煮沸裂解法，小量一步提取法等。 質(zhì)粒提取方法中，最常用的是堿裂解法，它具有得率高，適用面廣，快速，純度高等特色。堿裂解法是根據(jù)共價閉合環(huán)狀DNA與線性DNA的拓撲學結(jié)構(gòu)差異來分離的。其原理是：在強堿環(huán)境（pH12.0-12.6）下，細菌的細胞壁和細胞膜被SDS破壞，基因組DNA和質(zhì)粒DNA被釋放出來，宿主細胞的蛋白質(zhì)、染色體及線性DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)被破壞而發(fā)生變性（質(zhì)粒DNA因為其分子量小而纏結(jié)嚴密不易變性）。雖然在強堿的條件下共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA也會發(fā)生變性，但兩條互補鏈仍會互相盤繞，并緊密的結(jié)合在一起。當加入pH4.8的乙醋酸鉀高鹽緩沖液使pH恢復(fù)中性時，共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA復(fù)性快（可恢復(fù)天然構(gòu)象），而線性的染色體DNA復(fù)性緩慢，細菌蛋白質(zhì)、破裂的細胞壁和變性的染色體DNA會相互纏繞成大型復(fù)合物，后者被十二烷基硫酸鹽包蓋。當用鉀離子取代鈉離子時，復(fù)合物會從溶液中有效地沉淀下來，離心除去變性劑后，就可以從上清中回收復(fù)性的質(zhì)粒DNA（在高鹽條件下，細胞碎片、變性的蛋白質(zhì)和染色體DNA發(fā)生沉積，離心后可去除。上清中的質(zhì)粒DNA可經(jīng)過乙醇沉積或許硅膠膜特異性吸附等方法，將質(zhì)粒DNA從上清中回收）。 總結(jié)來說，堿裂解法主要使用三種溶液（根據(jù)1979年J.Doly發(fā)表文章A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA,也就是經(jīng)常說的堿裂解法)。The principle of alkaline extraction就是選擇性地讓chromosomal DNA發(fā)生變性，而plasmid DNA不會發(fā)生變性，仍然以雙鏈形式存在。 在溶液Ⅰ中：Lysozyme可以溶解細胞壁，對于一些細胞壁比較厚的細菌，加入Lysozyme，是不錯的選擇，但是我們?nèi)粘Ｌ崛≠|(zhì)粒的試劑盒似乎在溶液Ⅰ中沒有添加Lysozyme。EDTA或者CDTA是金屬離子螯合劑，能夠螯合Ca2+、Mg2+等二價金屬離子。大腸桿菌是革蘭氏陰性菌，細胞壁最外層是脂多糖LPS，攜帶負電荷。要維系LPS的穩(wěn)定性，必須要有足夠多的Ca2+。如果用EDTA螯合掉Ca2+，就會使LPS解體，暴露出內(nèi)層的肽聚糖，因而容易被Lysozyme水解。Ca2+、Mg2+也是細胞膜的重要成分，同時，對于細胞內(nèi)很多酶的活性至關(guān)重要。EDTA可以破壞細胞膜，抑制細胞內(nèi)許多酶的活性，比如核酸酶，防止DNA被降解掉。Glucose可以給細胞一個osmotic shock(滲透壓)，導(dǎo)致細胞壁和細胞膜裂解，還有一種說法，Glucose可以增加溶液的黏稠度。使細胞不至于快速沉降。J.Doly文章只提到一句，用Glucose可以更精確控制溶液PH，不太明白其中的原理。 在溶液Ⅱ中：SDS能夠破壞細胞壁，讓細胞內(nèi)容物(Lysate)釋放出來，還可以使蛋白變性，性，結(jié)合到蛋白質(zhì)表面。在這個過程中，chromosomal DNA會被降解成線性片段，一旦遇到強堿（12.0-12.5），chromosomal DNA會發(fā)生變性分離變成單鏈，但是plasmid DNA對此PH范圍耐受，仍然以雙鏈形式存在。 在溶液Ⅲ中：加入醋酸鈉可以中和強堿，chromosomal DNA發(fā)生復(fù)性，但是無法恢復(fù)原來天然的雙鏈結(jié)構(gòu)，而是形成一團纏繞在一起無法溶解的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。高濃度的鈉鹽溶液可以讓SDS-protein-chromosomal DNA復(fù)合物沉淀析出。接來下通過高速離心，SDS-protein-chromosomal DNA復(fù)合物，其他的細胞裂解物全部沉淀管底，只有plasmid DNA溶解在上清中。 大，小和中提的區(qū)別和應(yīng)用 質(zhì)粒抽提按得到質(zhì)粒DNA的量可分為小提，中提，大提。 質(zhì)粒小提用的菌液量很少，一般1-5ml，提出的質(zhì)粒DNA量較少，其特點是簡便、快速，能同時處理大量試樣，所得DNA有一定純度，此質(zhì)粒DNA可直接用于DNA序列分析，各種酶促反應(yīng)，PCR以及部分細胞系的轉(zhuǎn)染等對質(zhì)粒濃度要求不高的實驗。維真生物采用高通量小提試劑盒，從1ml菌液中提取質(zhì)粒，用90ul洗脫液洗脫得到的質(zhì)粒濃度為100-200ng/ul，可以滿足大部分實驗要求，也可以直接用于一般的腺病毒包裝，不過維真生物慢病毒、腺相關(guān)病毒（AAV）包裝一般使用大提試劑盒進行抽提，以保證高滴度及穩(wěn)定的質(zhì)量。 質(zhì)粒中提得到的質(zhì)粒DNA的量介于小提跟大提之間，一般用30-50ml菌液提取，提取的質(zhì)�？捎糜诎盖小CR、測序、連接、轉(zhuǎn)化、文庫篩選、體外翻譯、轉(zhuǎn)染一些常規(guī)的傳代細胞等。從50ml菌液中提取質(zhì)粒可到到500ul質(zhì)粒濃度為0.7-1ug/ul的質(zhì)粒。 質(zhì)粒大提是質(zhì)粒大量提取的簡稱，有些實驗室稱之為大抽。質(zhì)粒大提用于大量菌液的提取，100ml-500ml 均可，大規(guī)模地從細菌中將擴增的質(zhì)粒提取出來。一般的大提質(zhì)粒試劑盒都是使用純化柱，提取出來的質(zhì)粒純度高，雜質(zhì)少，無內(nèi)毒素，一般用于細胞的轉(zhuǎn)染等對質(zhì)粒純度高的實驗。從200ml菌液中提取質(zhì)粒，1000ul洗脫液洗脫后得到的質(zhì)粒濃度為0.5-2ug/ul。維真生物慢病毒、腺相關(guān)病毒（AAV）包裝一般使用大提試劑盒進行抽提，以保證高滴度及穩(wěn)定的質(zhì)量。 注：在一個細菌細胞中只有5個以下的相同質(zhì)粒時，該質(zhì)粒是低拷貝質(zhì)粒；當在一個細菌細胞中可以有幾百個相同質(zhì)粒時則該質(zhì)粒是高拷貝質(zhì)粒。低拷貝質(zhì)粒在等量的菌體中的數(shù)量遠低于高拷貝質(zhì)粒，因此用等量菌體提取質(zhì)粒時，提取的低拷貝質(zhì)粒的濃度會很低。維真生物的過表達載體是低拷貝質(zhì)粒，對于此類質(zhì)粒載體，若需要大量質(zhì)粒或者小提質(zhì)粒的實驗效果不好時，則需要加大提取的菌體量，可進行質(zhì)粒中提或者大提，另外，使用去內(nèi)毒素的試劑盒抽提質(zhì)粒時，也會降低最終得到質(zhì)粒的濃度。 注：感受態(tài)菌株是模式菌株，沒有質(zhì)粒，是為了擴增目的質(zhì)粒而生的，否則再轉(zhuǎn)化進目的質(zhì)粒后就會混合了。 質(zhì)粒提取試劑盒選擇 1、小提質(zhì)粒：（特點）簡單快速，可高通量提取 ；（濃度）100-200ng/ul；（用途）測序，PCR，腺病毒包裝、多數(shù)細胞轉(zhuǎn)染實驗 2、中提質(zhì)粒：（特點）質(zhì)粒DNA量較高，（濃度）0.7-1ug/ul；（用途）測序，多數(shù)細胞轉(zhuǎn)染實驗 3、大提質(zhì)粒：（特點）質(zhì)粒DNA量非常高，雜質(zhì)少，無內(nèi)毒素（濃度）0.5-2ug/ul （用途）慢病毒、腺相關(guān)病毒包裝，多數(shù)細胞轉(zhuǎn)染或其他需要大量質(zhì)粒的實驗。 大多數(shù)試劑盒都是在堿裂解法的基礎(chǔ)上優(yōu)化改進的。 對于小量制備的質(zhì)粒DNA， 經(jīng)過苯酚、氯仿抽提，RNA 酶消化和乙醇沉淀等簡單步驟去除殘余蛋白質(zhì)和RNA，所得純化的質(zhì)粒DNA 已可滿足細菌轉(zhuǎn)化、DNA 片段的分離和酶切、常規(guī)亞克隆及探針標記等要求，故在分子生物學實驗室中常用。 分享一種提取質(zhì)粒的方法 試劑準備： 1. 溶液Ⅰ: 50mM 葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH 8.0）。1M Tris-HCl(pH 8.0）12.5ml，0.5M EDTA（pH 8.0）10ml，葡萄糖4.730g，加ddH2O 至500ml。在10 lbf/in2 高壓滅菌15min ，貯存于4℃。 2. 溶液Ⅱ：0.2N NaOH，1% SDS。2N NaOH 1ml，10%SDS 1ml，加ddH2O 至10ml。使用前臨時配置。 3. 溶液Ⅲ：醋酸鉀（KAc）緩沖液，pH 4.8。5M KAc 300ml，冰醋酸57.5ml，加ddH2O 至500ml。4℃保存?zhèn)溆谩?br /> 4. TE：10mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA(pH 8.0)。1M Tris-HCl（pH 8.0）1ml，0.5M EDTA（pH 8.0）0.2ml，加ddH2O 至100ml。15 lbf/in2 高壓濕熱滅菌20min，4℃保存?zhèn)溆谩?br /> 5. 苯酚/氯仿/異戊醇（25：24：1） 6. 乙醇（無水乙醇、70%乙醇） 7. 5×TBE：Tris 堿54g， 硼 酸 27.5g，EDTA-Na2·2H2O 4.65g， 加 ddH2O 至1000ml。15 lbf/in2 高壓濕熱滅菌20min，4℃保存?zhèn)溆谩?br /> 8. 溴化乙錠（EB）：10mg/ml 9. RNase A（RNA 酶 A）：不含 DNA 酶(DNase-free) RNase A 的 10mg/ml，TE 配制，沸水加熱15min，分裝后貯存于-20℃。 10. 6×loading buffer（上樣緩沖液）：0.25%溴酚藍，0.25%二甲苯青 FF，40%（W/V）蔗糖水溶液。 11. 1% 瓊脂糖凝膠：稱取1g 瓊脂糖于三角燒瓶中，加100ml 0.5×TBE，微波爐加熱至完全溶化，冷卻至60℃左右，加 EB 母液（10mg/ml）至終濃度0.5μg/ml（注意：EB為強誘變劑，操作時帶手套），輕輕搖勻。緩緩倒入架有梳子的電泳膠板中，勿使有氣泡，靜置冷卻30min 以上，輕輕拔出梳子，放入電泳槽中（電泳緩沖液 0.5×TBE），即可上樣。 操作步驟： 1. 挑取LB 固體培養(yǎng)基上生長的單菌落，接種于2.0ml LB（含相應(yīng)抗生素）液體培養(yǎng)基中，37℃、250g 振蕩培養(yǎng)過夜（約 12-14hr）。 2. 取1.5ml 培養(yǎng)物入微量離心管中，室溫離心8000g×1min，棄上清，將離心管倒置，使液體盡可能流盡。 3. 將細菌沉淀重懸于100μl 預(yù)冷的溶液Ⅰ中，劇烈振蕩，使菌體分散混勻。 4. 加 200μl 新鮮配制的溶液Ⅱ，顛倒數(shù)次混勻（不要劇烈振蕩），并將離心管放置于冰上2-3min，使細胞膜裂解（溶液Ⅱ為裂解液，故離心管中菌液逐漸變清）。 5. 加入150μl 預(yù)冷的溶液Ⅲ，將管溫和顛倒數(shù)次混勻，見白色絮狀沉淀，可在冰上放置3-5min。溶液Ⅲ為中和溶液，此時質(zhì)粒 DNA 復(fù)性，染色體和蛋白質(zhì)不可逆變性，形成不可溶復(fù)合物，同時K+使SDS-蛋白復(fù)合物沉淀。 6. 加入450μl 的苯酚/氯仿/異戊醇，振蕩混勻，4℃離心 12000g × 10min。 7. 小心移出上清于一新微量離心管中，加入2.5 倍體積預(yù)冷的無水乙醇，混勻， 室溫放置 2-5min，4℃離心 12000g×15min。 8. 1ml 預(yù)冷的70%乙醇洗滌沉淀1-2 次，4℃離心 8000g×7min，棄上清，將沉淀在室溫下晾干。 9. 沉淀溶于 20μl TE（含 RNase A 20μg/ml），37℃水浴 30min 以降解 RNA 分子，-20℃保存?zhèn)溆谩?br /> 質(zhì)粒DNA 的電泳檢測： 觀察瓊脂凝膠中DNA 的最簡單方法是利用熒光染料溴化乙錠進行染色。該物質(zhì)含有一個可以嵌入DNA 的堆積堿基之間的一個平面基團，這個基團的固定位置及其與堿基的密切接近，導(dǎo)致染料與DNA 結(jié)合并呈現(xiàn)熒光，其熒光產(chǎn)率比游離染料溶液有所增加。 DNA 吸收254nm 處的紫外輻射并傳遞給染料，而被結(jié)合的染料本身則在302nm 和366nm 有光吸收。這兩種情況下，被吸收的能量可在可見光譜紅橙區(qū)的590nm 處重新發(fā)射出來。因此，當凝膠中含有游離溴化乙錠時即可以檢測到少量的DNA。 取制備的質(zhì)粒DNA 1-2μl，加適當loading buffer 混勻上樣,采用1-5V/cm 的電壓，使DNA 分子從負極向正極移動至合適位置，取出凝膠置紫外燈下檢測， 攝片。 注意事項： 本裂解法小量制備質(zhì)粒DNA 重復(fù)性好，一般無麻煩。若所提取質(zhì)粒DNA 不能被限制性內(nèi)切酶切割，可通過酚/氯仿再次抽提，以清除雜質(zhì)來解決問題。 質(zhì)粒提取常見問題及解決方案 1、菌液較多：可以通過幾次離心將菌體沉淀收集到一個離心管中。收集的菌體量以能夠充分裂解為佳，菌體過多裂解不充分會降低質(zhì)粒的提取效率。未徹底混勻的菌塊會影響裂解，導(dǎo)致提取量和純度偏低，菌體懸浮后若有較多的氣泡也會影響裂解，導(dǎo)致導(dǎo)致提取量和純度偏低。質(zhì)粒提取使用的溶液I主要是懸浮菌體，溶液II裂解菌體，其中的高濃度NaOH破會細菌細胞壁和細胞膜，使菌體中的質(zhì)粒DNA釋放出來，溶液III主要是中和溶液，使溶液恢復(fù)中性環(huán)境，利于質(zhì)粒DNA復(fù)性，溶液II中SDS的Na+會被K+置換，SDS變?yōu)镻DS并結(jié)合大分子的基因組DNA,蛋白質(zhì)和細胞碎片形成不溶物，然后通過離心可以得到含有質(zhì)粒DNA的上清。因此加入溶液II后要溫和地混合，不要劇烈震蕩，以免使基因組DNA斷裂污染質(zhì)粒。所用時間不應(yīng)超過5min，以免質(zhì)粒受到破壞。如果菌液沒有變清亮，可能是由于菌體過多，裂解不徹底，若繼續(xù)進行后續(xù)操作會得到鼻涕狀的沉淀，無法通過離心分離得到含有DNA 的上清液，因此在加入溶液Ⅱ后菌液沒有變清亮后可以適當按比例加大溶液Ⅱ和后續(xù)溶液Ⅲ的用量。 2、菌液培養(yǎng)時間：使用TB培養(yǎng)基培養(yǎng)菌液的時間一般在16小時左右，菌液OD值在2.5-2.6左右為佳，培養(yǎng)時間短會導(dǎo)致菌體生長不充分，培養(yǎng)時間過長菌體會出現(xiàn)死亡，導(dǎo)致活菌比例降低，進而基因組DNA污染概率增大。培養(yǎng)時間應(yīng)優(yōu)選的控制在12-16 h內(nèi)。 3、宿主菌株：宿主菌株的種類將會影響質(zhì)粒的收獲量。含內(nèi)源核酸酶的宿主菌株，HB101, 如JM101, JM110, TG1以及它們的衍生菌株，通常因為內(nèi)源核酸酶的存在，或者在提取過程中釋放出來的核酸酶的作用下，將會顯著影響最終收獲量，或者純化到的質(zhì)粒容易降解，推薦將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至不含內(nèi)源核酸酶的宿主菌株中，如Top10, DH5a進行質(zhì)粒純化。 4、質(zhì)�？截悢�(shù)低：由于使用低拷貝數(shù)載體引起的質(zhì)粒DNA提取量低，可更換具有相同功能的高拷貝數(shù)載體，或者加大提取的菌液量，并減小洗脫時的體積。當所提取的質(zhì)粒大于10 kb時，由于菌體承載力有限，大質(zhì)粒復(fù)制效率往往會低于普通質(zhì)粒，因此推薦增大菌液量以獲得更好的提取產(chǎn)量。 5、菌體中無質(zhì)粒：有些質(zhì)粒本身不能在某些菌種中穩(wěn)定存在，經(jīng)多次轉(zhuǎn)接后有可能造成質(zhì)粒丟失。例如，柯斯質(zhì)粒在大腸桿菌中長期保存不穩(wěn)定，因此不要頻繁轉(zhuǎn)接，每次接種時應(yīng)接種單菌落。有時菌種保存一段時間后會出現(xiàn)質(zhì)粒丟失的情況，導(dǎo)致無法提出質(zhì)粒，若有保存的質(zhì)粒可以轉(zhuǎn)化后再挑取單克隆搖菌提質(zhì)粒。另外，檢查篩選用抗生素使用濃度是否正確。 6、堿裂解不充分：使用過多菌體培養(yǎng)液，會導(dǎo)致菌體裂解不充分，可減少菌體用量或增加裂解液的用量。并確保細菌混懸均勻。菌體沉淀未能充分懸浮或懸浮后有較多氣泡也會導(dǎo)致裂解不充分，要注意讓菌體充分懸浮并將較多的氣泡用移液器吸出。對低拷貝數(shù)質(zhì)粒，提取時可加大菌體用量并加倍使用試劑盒溶液，可以有助于增加質(zhì)粒提取量和提高質(zhì)粒質(zhì)量。 7、溶液使用不當：溶液II在溫度較低時可能出現(xiàn)渾濁，可置于42℃水浴保溫片刻直至溶解為清亮的溶液，方可使用。 8、吸附柱過載：不同產(chǎn)品中吸附柱吸附能力不同，如果需要提取的質(zhì)粒量很大，請分多次提取。若用富集培養(yǎng)基，例如TB或2×YT，菌液體積必須減少;若質(zhì)粒是非常高的拷貝數(shù)或宿主菌具有很高的生長率，則需減少LB培養(yǎng)液體積。 9、質(zhì)粒未全部溶解(尤其質(zhì)粒較大時) ：洗脫溶解質(zhì)粒時，可適當加溫或延長溶解時間。 10、乙醇殘留：漂洗液洗滌后應(yīng)離心盡量去除殘留液體，再加入洗脫緩沖液。漂洗液中乙醇的殘留會影響后續(xù)的酶反應(yīng)（酶切、PCR等）實驗。為確保下游實驗不受殘留乙醇的影響，可置于室溫靜置20-30分鐘，或放到超凈臺上風吹15分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。 11、鹽離子污染：當漂洗操作不當或漂洗不充分時將導(dǎo)致鹽離子污染，該指標可通過OD260/230比值鑒定，通常大于2.0是可接受的。在使用試劑盒時應(yīng)確保Wash Buffer的漂洗次數(shù)和漂洗液加入量。 11、洗脫液加入位置不正確：洗脫液應(yīng)加在硅膠膜中心部位以確保洗脫液會完全覆蓋硅膠膜的表面達到最大洗脫效率。若第一次沒有將洗脫液準確加到硅膠膜的中心部位，可以離心后將離心下來的洗脫液按正確方式重新上柱再次洗脫。 12、洗脫液不合適：DNA只在低鹽溶液中才能被洗脫，如洗脫緩沖液EB(10mM Tris-HCl, 1mM EDTA，pH8.5)或水。洗脫效率還取決于pH值，最大洗脫效率在pH 7.0-8.5間。當用水洗脫時確保其pH值在此范圍內(nèi)，如果pH過低可能導(dǎo)致洗脫量低。洗脫時將滅菌蒸餾水或洗脫緩沖液加熱至60℃后使用，有利于提高洗脫效率。為追求高濃度質(zhì)粒而減小洗脫液體積將會導(dǎo)致洗脫不充分進而降低產(chǎn)量，因此要確保洗脫液的用量，此外Elution Buffer預(yù)熱至60℃和重復(fù)洗脫將更有利于洗脫效率提升。 13、洗脫體積太�。合疵擉w積對回收率有一定影響。隨著洗脫體積的增大回收率增高，但產(chǎn)品濃度降低。為了得到較高的回收率可以增大洗脫體積。 14、洗脫時間過短：洗脫時間對回收率也會有一定影響。洗脫時在說明書的建議時間基礎(chǔ)上適當延長靜置或者洗脫兩次可達到較好的效果。 |
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阿爾法啊 2026-03-01 | 3/150 |
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[考研] 306分材料調(diào)劑 +5 | chuanzhu川燭 2026-03-01 | 6/300 |
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[考研] 275求調(diào)劑 +7 | 明遠求學 2026-03-01 | 7/350 |
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[考研] 求調(diào)劑 +3 | 熬夜的貓頭鷹 2026-03-02 | 3/150 |
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[考研] 279求調(diào)劑 +3 | dua1 2026-03-01 | 4/200 |
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[考研] 272求調(diào)劑 +6 | 田智友 2026-02-28 | 6/300 |
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[考研] 299求調(diào)劑 +3 | Y墨明棋妙Y 2026-02-28 | 5/250 |
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[考博] 26申博 +4 | 想申博！ 2026-02-26 | 6/300 |
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[考研] 313求調(diào)劑 +3 | 水流年lc 2026-02-28 | 3/150 |
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[考研] 調(diào)劑 +3 | 簡木ChuFront 2026-02-28 | 3/150 |
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