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科研實驗_研實新蟲 (小有名氣)
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簡單PCR實驗驗證如何發(fā)IF7+的文章？這篇文獻告訴你
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今天跟大家分享一篇7+的非腫瘤生信文章，文章主要對結(jié)核患者進行程序性細胞死亡相關(guān)的分類并關(guān)聯(lián)了免疫細胞分析。這篇文章于2023年5月發(fā)表在Frontiers in immunology（中科院2區(qū), IF=7.3）上，文章標題：Classification of tuberculosis-related programmed cell death-related patient subgroups and associated immune cell profiling。 圖片 PART.01 研究背景 結(jié)核�。═B）是世界范圍內(nèi)嚴重的傳染病。程序性細胞死亡（PCD）模式在許多疾病狀態(tài)的發(fā)展和進展中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，因此它們可能成為有效的生物標志物或治療靶點，幫助識別和治療結(jié)核病患者。 作者分析了結(jié)核病中PCD相關(guān)基因表達與免疫細胞浸潤之間的關(guān)系，同時也揭示了基于PCD相關(guān)基因聚類分組的結(jié)核病患者免疫應答的差異。同時機器學習模型的使用能夠有效地選擇核心PCD相關(guān)基因。 PART.02 研究方法 數(shù)據(jù)獲取和PCD相關(guān)基因的鑒定。由于本文研究的是非腫瘤疾病，作者在GEO數(shù)據(jù)中進行篩選，最終選定11個數(shù)據(jù)集用于后續(xù)的分析。另外，作者通過GSEA和KEGG基因集，綜述，人工整理的方式確定了PCD相關(guān)基因。 差異表達基因的識別和分析。作者利用R包“l(fā)imma”鑒定差異表達基因，后續(xù)基于DAVID網(wǎng)站進行了GO和KEGG富集分析，并利用R進行了GSVA分析。 免疫細胞富集分析。作者基于R包CIBERSORT算法計算每個樣本中的免疫細胞豐度。 單細胞數(shù)據(jù)分析。作者從NCBI Short Read Archive獲取原始數(shù)據(jù)，進行處理后進行聚類分析，并根據(jù)標記基因?qū)垲愡M行注釋。 機器學習分析。作者主要進行了LASSO, SVM-RFE, RF, and Xgboost機器學習分析方法，這些分析是基于R包glmnet”, “kernlab”, “randomForest”, “xgboost”進行的。 諾姆圖的構(gòu)建和驗證。作者繪制了諾姆圖，并利用DCA曲線和ROC曲線進行驗證。 亞群分析。使用R包R“ConsensusClusterPlus”，基于核心PCD相關(guān)基因的表達進行共識聚類，確定了數(shù)據(jù)集中患者的亞群。 qPCR分析。作者基于10名結(jié)核患者和10名健康患者的樣本，對7個關(guān)鍵PCD相關(guān)基因的表達進行了檢驗。 潛在治療復合物的鑒定。作者利用CMap網(wǎng)站，基于基因和藥物之間的關(guān)系鑒定潛在的對疾病有效的分子。 PART.03 研究結(jié)果 圖片 圖1：健康對照組和結(jié)核組基因表達的分布 圖片 圖2：差異表達基因的功能富集分析，包括GO：BP，GO：CC, GO：MF和KEGG分析 圖片 圖3：健康對照組和結(jié)核組免疫細胞浸潤分析，展示免疫細胞的富集情況和比例 圖片 圖4：差異表達基因和PCD相關(guān)基因有14個交集基因，并展示了這14個基因的表達情況 圖片 圖5：基于機器學習選擇基因選擇PCD相關(guān)特征基因集 圖片 圖6：作者基于機器學習篩選出的7個PCD相關(guān)基因構(gòu)建了諾姆圖，并繪制Calibration圖和DCA曲線驗證諾姆圖，另外基于7個基因繪制了ROC曲線 圖片 圖7：7個PCD相關(guān)基因的單細胞數(shù)據(jù)分析 圖片 圖8：PCD相關(guān)基因高低表達組的GSEA分析 圖片 圖9：基于PCD相關(guān)基因利用無監(jiān)督聚類對患者進行分類 圖片 圖10：不同亞組患者的GAVA通路分析 圖片 圖11：不同亞組患者的功能富集分析和免疫細胞富集分析 圖片 圖12: 基于無監(jiān)督聚類在結(jié)核相關(guān)疾病中鑒定PCD相關(guān)亞型 圖片 圖13：結(jié)核相關(guān)疾病亞群中22種免疫細胞類型相對富集的差異 圖片 圖14：qPCR結(jié)果顯示7個核心PCD相關(guān)基因的表達水平 圖片 圖15：PCD相關(guān)差異表達基因的CMap評分熱圖 PART.04 總結(jié) 本文一共15張figure，除了Figure 14是利用臨床樣本進行了PCR驗證，其余均是生信分析的結(jié)果。文章的具體分析思路和內(nèi)容如下： 作者基于GEO數(shù)據(jù)庫對健康對照組和結(jié)核組進行了基因差異分析，鑒定出了138個上調(diào)基因和11個下調(diào)基因（Figure 1）。接著，作者對這些基因進行了功能富集分析，并富集到免疫相關(guān)通路（Figure 2）。隨后，作者進一步分析了健康對照組和結(jié)核組中免疫細胞的浸潤情況，免疫細胞表現(xiàn)出不同的富集程度，這表明免疫在結(jié)核的進展中發(fā)揮作用，并且這一發(fā)現(xiàn)在單細胞數(shù)據(jù)中同樣得到驗證（Figure 3）。 作者基于差異表達基因和收集到的PCD相關(guān)基因取交集，得到14個基因，對這14個基因進行四種機器學習分析，最終取7個交集基因作為核心PCD相關(guān)基因（Figure 4-5）。作者基于核心PCD相關(guān)基因構(gòu)建了諾姆圖并驗證其效果，還繪制了ROC曲線驗證核心PCD相關(guān)基因的預后預測效果（Figure 6）。隨后，作者分析了核心PCD相關(guān)基因與免疫浸潤的關(guān)系，基于單細胞數(shù)據(jù)作者發(fā)現(xiàn)6個核心PCD相關(guān)基因與CD8+T細胞和Tfh細胞有強烈的負相關(guān)，這6個基因與中性粒細胞、活化的樹突細胞、單核細胞、M0巨噬細胞、M1巨噬細胞、M2巨噬細胞和調(diào)節(jié)性T細胞的豐度顯著正相關(guān)。這些結(jié)果表明核心PCD相關(guān)基因在結(jié)核病免疫浸潤中的重要作用（Figure 7）。另外，GSEA方法也表明這7個核心PCD相關(guān)基因在病毒感染和免疫相關(guān)活性相關(guān)的通路中富集（Figure 8）。 接下來，作者基于7個核心PCD相關(guān)基因進行無監(jiān)督聚類，將患者分為兩個亞組（Figure 9）。并基于兩個亞組進行了GSVA富集分析（Figure 10）。作者還比較了兩個亞組間的差異表達基因，并進行了差異基因的功能富集分析，并比較了兩個亞組間免疫細胞浸潤的情況 （Figure 11）。 在結(jié)核相關(guān)的疾病中，作者同樣基于7個核心PCD相關(guān)基因進行無監(jiān)督聚類，病種包括類風濕性關(guān)節(jié)炎（RA）、慢性阻塞性肺病（COPD）、間質(zhì)性肺�。↖LD）、哮喘（Asm）、COVID-19、肺腺癌（LA）和系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）（Figure 12）。進一步地，作者比較了不同亞組間的免疫浸潤情況（Figure 13）。 作者收集了10例結(jié)核患者和10例正常人的外周血，PCR驗證了7個核心PCD相關(guān)基因在結(jié)核患者中高表達（Figure 14）。 為了研究結(jié)核相關(guān)疾病高�；颊叩臐撛谒幬铮捎肅Map分析預測抗疾病小分子化合物（Figure 15）。 PART.05 研究拓展 這篇文章有幾個亮點： 1.這篇文章針對的疾病不是腫瘤，相對而言非腫瘤疾病在生信方向上待挖掘的更多一些。 2.文中篩選核心基因時候利用了多種機器學習方法，有利于篩選出更準確的標志物。 3.在進行免疫細胞浸潤的分析時，作者利用不同維度的數(shù)據(jù)（bulk層面和單細胞層面）分別進行了分析，使結(jié)果更有可信度。 4.作者基于核心PCD相關(guān)基因在結(jié)核患者中進行聚類，另外還在多種結(jié)核相關(guān)疾病中也進行了分析，這能體現(xiàn)出核心PCD相關(guān)基因應用的廣泛性。 但是，文章也有一些不足之處，例如這幾個基因僅僅在RNA水平上進行了驗證，實驗上相對來說較少。另外，文章的圖片數(shù)量過多，結(jié)果展示較為分散，對一些圖片進行組合后展示可能更有利于描述結(jié)果部分。 總體來說，該文瑕不掩瑜，文章的部分分析思路也可以為基金撰寫提供思路，例如研究某個病種的某種相關(guān)表型時，可以先通過公共數(shù)據(jù)進行分析，找出差異基因，與表型相關(guān)的基因集取交集，獲得一些重要的候選分子進行后續(xù)的研究。 |
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