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細胞實驗 | 破骨細胞的傳代、凍存與復(fù)蘇
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實驗動物 成年SPF級雄性SD大鼠1只， 體重250g。 實驗方法及步驟 01 外周血單個核細胞分離 ✦ （1）標本采集：取SPF 成年 SD 大鼠 1 只，3％戊巴比妥鈉，按動物體重0.15 ml/100g，腹腔注射麻醉。無菌操作下腹主動脈采血6 ml，注入肝素抗凝管中。 （2）單個核細胞分離：采用密度梯度離心法， 向采集的血樣標本內(nèi)加入等量的PBS，取4支15ml離心管，分別加入大鼠淋巴細胞分離液各3ml，再緩緩向各離心管內(nèi)加入上述含PBS血樣各3ml，然后以2000r／min，水平離心20min，取出后在絮狀層小心吸取單個核細胞，分別收集到2支離心管中，PBS清洗2次，備作重懸培養(yǎng)。 02 破骨細胞的誘導(dǎo)培養(yǎng) ✦ 將分離純化的大鼠周圍血單個核細胞，用含10％FBS、50ng／mlRANKL、20ng ／mlM－CSF、100U／ml青霉素、100U／ml鏈霉素的 α－MEM培養(yǎng)液重懸，調(diào)整細胞密度為1×105個／ml。再將配制好的細胞懸液接種到6孔培養(yǎng)板與直徑35 mm培養(yǎng)皿中。直徑35mm培養(yǎng)皿用于活細胞工作站動態(tài)跟蹤成像，6孔培養(yǎng)板置 于CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，在37℃、5％CO2、飽和濕度下連續(xù)培養(yǎng)，用上述含RANKL、M－CSF的α-MEM 培養(yǎng)液換液，每3日1次。同時對整個培養(yǎng)過程作相差顯微鏡觀察與活細胞成像，培養(yǎng)14 d作抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色。 03 破骨細胞的傳代 ✦ 大鼠周圍血單個核細胞經(jīng)RANKL、M－CSF 誘導(dǎo)培養(yǎng)2周，形成大量貼壁的多核破骨細胞后，從培養(yǎng)箱中取出，將培養(yǎng)液吸凈，加入37 ℃預(yù)溫的D－Hank＇s液，沖洗2次，再滴加足量的0.25％胰蛋白酶液，使其覆蓋整個底面，置于37 ℃培養(yǎng)箱中消化5min后取出，震蕩1min左右，在倒置相差顯微鏡下觀察，當大部分細胞收縮懸起后，加入α－MEM完全培養(yǎng)液終止消化，用吸管反復(fù)抽吸吹打，將細胞混勻后移入15ml離心管，2000r／min，離心5min，去上清，用含RANKL、M－CSF的α－MEM完全培養(yǎng)液重懸細胞， 調(diào)整濃度至1×105個／ml，接種細胞至6孔培養(yǎng)板與直徑35mm 培養(yǎng)皿中。同時對消化與貼壁過程作活細胞成像觀察，3d后作TRAP染色。 04 破骨細胞的凍存 ✦ 按破骨細胞傳代方法，將誘導(dǎo)培養(yǎng)的破骨細胞制成細胞懸液，2000r／min，離心5min，去上清，用DMSO、FBS、α－MEM 按1∶2∶7 比例配制的凍存液，重懸細胞，調(diào)整細胞濃度至5×106個／ml，加入凍存管，每支1.5ml，用凍存罐在溫度為－80℃冰箱中放置24h，再移至－196 ℃液氮中凍存。 05 破骨細胞的復(fù)蘇 ✦ 從液氮中取出凍存的破骨細胞，迅速在 37 ℃水浴中震蕩融解，將融解的細胞懸液加入15ml離心管中，再加6ml α－MEM完全培養(yǎng)液，混勻，2000r／min，離心5min，去上清，用含RANKL、M－CSF 的α －MEM完全培養(yǎng)液，按1×105個／ ml的細胞濃度重懸后，分別接種到6孔培養(yǎng)板與直徑35mm培養(yǎng)皿中。同時對接種后的貼壁過程作活細胞成像觀察，3d后作TRAP染色。 觀察項目與方法 01 活細胞成像觀察 ✦ （1）破骨細胞誘導(dǎo)培養(yǎng)的活細胞成像 觀察：取直徑35mm培養(yǎng)皿，將其置于活細胞工作站倒置顯微鏡的培養(yǎng)室中，在相差觀察模式、20倍物鏡下，以1f／6s的采集速度，對整個培養(yǎng)過程作序列圖像捕獲，進行單幀圖像分析與縮時視頻動態(tài)觀察。 （2）破骨細胞傳代培養(yǎng)的活細胞成像 觀察：取直徑35mm培養(yǎng)皿培養(yǎng)的破骨細胞，將其置于活細胞工作站倒置顯微鏡的培養(yǎng)室中，在相差觀察模式、20倍物鏡下，選擇貼壁良好，胞質(zhì)充分展開，細胞核清晰可見的多核破骨細胞，調(diào)整到視野中心，然后將培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液吸凈，再用 37℃預(yù)溫的D－h(huán)ank＇s 液緩緩沖洗2遍，吸干。 以1 f／s的采集速度，開始序列圖像捕獲，同時向培養(yǎng)皿內(nèi)加入1ml 0.25％胰蛋白酶溶液，記錄破骨細胞在胰蛋白酶作用下的整個消化過程，約5min。當細胞胞體收縮，呈飽滿圓亮、半懸浮狀態(tài)時，加入2ml α－MEM 完全培養(yǎng)液終止消化，用吸管吹吸，使其形成均勻的細胞懸液，再移入2ml滅菌EP管，2000r／min離心3min，去上清，用含 RANKL、M－CSF 的α－MEM完全培養(yǎng)液重懸細胞，接種到另一個直徑35 mm培養(yǎng)皿，放回活細胞工作站的培養(yǎng)室中，再按上述方法選擇圓亮飽滿、體積較大的多核破骨細胞，置于觀察視野中心，以1f／6s采集速度進行序列圖像采集，觀察破骨細胞傳代后的整個貼壁過程。 （3）破骨細胞復(fù)蘇培養(yǎng)的活細胞成像 觀察：破骨細胞復(fù)蘇培養(yǎng)后，立即取直徑35mm培養(yǎng)皿培養(yǎng)的破骨細胞置于活細胞工作站的培養(yǎng)室中，按上述破骨細胞傳代后的活細胞成像觀察方法，進行序列圖像采集，觀察破骨細胞復(fù)蘇培養(yǎng)后的整個貼壁過程。 02 TRAP染色 ✦ 取培養(yǎng)細胞，吸凈孔內(nèi)培養(yǎng)液，用37 ℃預(yù)溫的PBS沖洗2次，再用2.5％戊二醛常溫下固定2min，去離子水漂洗3次。取堅牢石榴紅GBC溶液0.1ml和亞硝酸鹽溶液0.1ml，輕輕混合30s，靜止2min。將上液加入到9ml 預(yù)熱至37 ℃的去離子水中，再依次加入0.1ml萘酚AS－BI磷酸鹽溶液、0.4ml 醋酸鹽溶液、0.2ml 酒石酸鹽溶液，制得染色液。將染色液加入培養(yǎng)孔內(nèi)，37℃孵育，注意避光。15min后觀察染色效果，呈最佳效果時即終止染色，取出后去離子水沖洗，晾干，倒置顯微鏡下觀察，DP-72 數(shù)字成像系統(tǒng)采集圖像。 |
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