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[求助]
急求助谷氨酸棒桿菌ATCC13032感受態(tài)制備及電轉化操作方法，求這方面大神幫助
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| 第一次接觸谷氨酸棒桿菌，質粒轉化ATCC13032幾次都沒有轉化子，有沒有做谷氨酸棒桿菌電轉化的大神來指導一下。 |
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我目前按照下面的甘油法做感受態(tài)，現做現用，轉化兩次都不成功，能不能指導下問腿出在哪里？ 1,培養(yǎng)基 LBG培養(yǎng)基(g/l):酵母膏5,蛋白胨10,氯化鈉10,ph7.0,用于培養(yǎng)谷氨酸棒狀 桿菌制備感受態(tài)的種子液。 EPO培養(yǎng)基(g/l):酵母膏5,蛋白胨10,氯化鈉10,甘氨酸30,Tween80 1ml/l。 用于谷氨酸棒狀桿菌感受態(tài)的制備。 LBHIS培養(yǎng)基(g/l):酵母膏2.5,蛋白胨5,氯化鈉5,腦心浸液18.5,山梨醇91。用于谷氨酸棒狀桿菌轉化子的培養(yǎng)。 相應的固體培養(yǎng)基中加入2%的瓊脂粉。 谷氨酸棒桿菌的培養(yǎng)條件:30°C,200rpm。 2,谷氨酸棒狀桿菌感受態(tài)的制備: (1)將一環(huán)谷氨酸棒狀桿菌的種子接種于種子培養(yǎng)基中,200rpm,30°C過夜培養(yǎng)。 (2)以10%的比例轉接于100ml培養(yǎng)基中,使初始細胞OD達到0.3,200rpm30°C 培養(yǎng)3-5h至OD達到0.6-0.9. (3)將所有菌液放入50ml離心管中冰浴15min,4000rpm,4°C離心10min。 (4)取預冷的10%甘油約30ml,充分懸浮菌體,4000rpm,4°C離心10min (5)再次取預冷的10%甘油重復洗滌兩次。 (6)用400ul預冷的10%甘油重懸細胞,1.5ml離心管分裝,每管80ul,-70°C保 存或者點擊轉化。 3谷氨酸棒狀桿菌的電轉化法: (1)將新鮮制備(或者冰箱取出)感受態(tài)細胞和連接產物置于冰上，輕彈管壁使其混勻。 (2)吸取5ul 冰上預冷的質粒加入感受態(tài)細胞中,輕彈管壁使其勻,然后冰浴5-10min. (3)加入預冷的0.1cm 電擊杯中,1.8kv,5ms電擊。加入恢復用培養(yǎng)基LBHISml溫46°C水浴6min. (4)30°C，100rpm 培養(yǎng) 1h. (5)涂布含有抗生素的平板,30°C過夜培養(yǎng)觀察。 |
3樓2024-04-28 09:34:35
2樓2024-04-26 09:09:34
4樓2024-12-16 13:33:56
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