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生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)的基本操作-2
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二、一般操作技術(shù) 1、混勻法：欲使一化學(xué)反應(yīng)充分進(jìn)行，必須使反應(yīng)體系內(nèi)各種物質(zhì)迅速地相互接觸，因此除特別規(guī)定外，一般都需要將反應(yīng)物徹底混勻�；靹蚍绞酱笾掠幸韵聨追N，可隨使用的器皿的液體容量而選用。（1）旋轉(zhuǎn)混勻法：手持容器作離心旋轉(zhuǎn)，適用以未盛滿液體的試管或小口器皿，如三角瓶等。（2）彈指混勻法：左手持試管使之直立，以右手食指輕擊試管之下部，使管內(nèi)溶液作旋轉(zhuǎn)流動。（3）倒轉(zhuǎn)混勻法：適用于有玻璃塞的瓶子，如容量瓶等。（4）彈動混勻法：以右手大拇指、食指、中指握住試管上部，將試管放平，于左手掌中彈動。（5）吸管混勻法：用吸管將溶液反復(fù)吸放數(shù)次，適用于量少而無沉淀的液體。（6）攪拌混勻法：適應(yīng)燒杯等大口容器所盛之溶液的混勻，一般在配制混合試劑時，用玻棒攪拌以助溶，或混勻大量的溶液。2、保溫與加熱：為使某一化學(xué)反應(yīng)在一定的溫度下進(jìn)行，常需要保溫；為促進(jìn)或停止化學(xué)反應(yīng)，有時需要加熱。（1）保溫：常用恒溫箱或恒溫水浴進(jìn)行，后者的溫度較前者穩(wěn)定。（2）加熱：加熱常用兩種方法，一是直接把試管、燒杯等器皿在酒精燈、電爐或煤氣火焰上加熱；二是在水浴中加熱或煮沸，應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)的目的而定。3、過濾：過濾的目的是將沉淀與液體分開，可用濾紙、棉花、紗布等。生化實(shí)驗(yàn)中所進(jìn)行的過濾，為了不改變?nèi)芤旱臐舛�，一般不要用水濕潤濾紙。過濾所用的濾紙常折成多折狀，以增大過濾面積。當(dāng)過濾難濾之物或?yàn)榱思涌焖俣�，可采用減壓抽濾法。實(shí)驗(yàn)室中有時用離心法代替過濾。 三、實(shí)驗(yàn)樣品的制備 在生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)中，無論是分析組織中各種物質(zhì)的含量，還是研究組織中物質(zhì)代謝的過程，皆需利用特定的生物樣品。為了達(dá)到一定的實(shí)驗(yàn)?zāi)康模枰獙@得的樣品預(yù)先做適當(dāng)?shù)奶幚�。掌握�?shí)驗(yàn)樣品的正確處理方法乃是做好生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)的先決條件�；A(chǔ)生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)中，最常用的動物或人體樣品是全血、血清、血漿及無蛋白血濾液。組織樣品則常用肝、腎、胰、胃粘膜或肌肉等，實(shí)驗(yàn)時可制成組織勻漿、組織糜、組織切片或組織浸出液等形式。有關(guān)這些組織樣品的制備方法，扼要介紹如下：（一）血液樣品全血：無論是收集動物還是人的血液，均應(yīng)注意儀器的清潔與干燥，同時也要及時加入適當(dāng)?shù)目鼓齽┮苑乐寡旱哪�。一般在血液取出后，迅速盛于含有抗凝劑的器皿中，同時輕輕搖動，使血液與抗凝劑充分混合，以免形成小凝塊。取得全血如不立即進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，應(yīng)儲存于冰箱內(nèi)。常用的抗凝劑有草酸鹽、檸檬酸鹽、氟化鈉及肝素等，可視實(shí)驗(yàn)要求而選用。一般實(shí)驗(yàn)用草酸鹽即可，但它不適用于血鈣測定。氟化鈉因兼有抗凝及抑制糖酵解之作用，故可用于血糖測定。但因其也能抑制脲酶，故用脲酶測定尿素時，則不能應(yīng)用。肝素雖好，但價格較貴。 抗凝劑的用量不應(yīng)過多，否則影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。通常每毫升血液加1~2mg草酸鹽或5mg檸檬酸鈉或5~10mg氟化鈉，肝素僅需要0.01~0.2mg，最好抗凝劑制成適當(dāng)濃度的水溶液，然后取 0.5ml置于準(zhǔn)備盛血的器皿內(nèi)，再橫放蒸干（肝素不宜超過30℃），則抗凝劑在器皿壁上形成一層薄膜，使用時較為方便，效果較滿意。血漿：上述抗凝的全血在離心機(jī)中離心，所得的上清液即為血漿。如需用血漿進(jìn)行分析時，必須嚴(yán)格防止溶血，故采血時一切用具（注射器、針頭、試管等）皆需清潔干燥，取出的血液也不能劇烈振搖。血清：收集的血液不加抗凝劑，在室溫下放5~20分鐘即自行凝固。通常經(jīng)3小時，血塊收縮，析出清亮的血清。為了節(jié)省時間，必要時可離心分離血清。制備血清同樣須防止溶血。 無蛋白血濾液：分析血液中許多成分時，也常除去蛋白質(zhì)，制成無蛋白血濾液。如血液中的非蛋白氮、尿酸、肌酸等測定皆需先把血液制成無蛋白血濾液后，再進(jìn)行分析測定。蛋白質(zhì)沉淀劑如鎢酸、三氯醋酸或氫氧化鋅皆可用于制備無蛋白血濾液，可根據(jù)不同的需要而加以選擇。 （二）尿液樣品 一般定性實(shí)驗(yàn)只需將尿收集一次即可，但一天之中各次排出尿液的成分隨食物、飲水及一晝夜的內(nèi)生理變化等的影響而有很大的差異，因此定量測定尿液中各種成分皆應(yīng)收集24小時尿混合后取樣。通常在早晨一定時間排出殘余尿而棄去，以后每次尿皆收集于清潔大玻瓶中，到第二天早晨同一時間收集最后一次尿即可，隨即混合并用量筒量準(zhǔn)其體積。收集的尿液如不能立即進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，則應(yīng)置于冷處保存。必要時可在收集尿時即于收集的玻瓶中加入防腐劑如甲苯、鹽酸等，通常每升尿中約加入5ml甲苯或5ml鹽酸即可。如須收集動物尿液，可將動物置于代謝籠中，其排出之尿液經(jīng)籠下漏斗流入瓶中而收集之。 （三）組織樣品 離體不久的組織，在適宜的溫度及ｐH等條件下，可以進(jìn)行一定程度的物質(zhì)代謝。因此，在生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)中，常利用離體組織，研究各種物質(zhì)代謝的途徑與酶系的作用，也可以從組織中提取各種代謝物質(zhì)或酶進(jìn)行研究。但是各種組織離體過久后，都要發(fā)生變化。例如，組織中的某些酶在久置后發(fā)生變性而失活。有些組織成分如糖原、ATP等，甚至在動物死亡數(shù)分鐘至十幾分鐘內(nèi)，其含量即有明顯的降低，因此，利用離體組織作代謝研究或作為提取材料時，都必須迅速將它取出，并盡快地進(jìn)行提取或測定。一般采用斷頭法處死動物，放出血液，立即取出實(shí)驗(yàn)所需之臟器或組織，去除外層的脂肪及結(jié)締組織后，用冰冷之生理鹽水洗去血液，必要時也可用冰冷之生理鹽水灌注臟器以洗去血液，再用濾紙吸干，即可作實(shí)驗(yàn)之用。取出的臟器或組織，可根據(jù)不同的目的，用以下不同的方法制成不同的組織樣品。組織糜：將組織用剪刀迅速剪碎，或用絞肉機(jī)絞成糜狀即可。組織勻漿：新鮮組織稱取重量后剪碎，加入適當(dāng)?shù)膭驖{制備液，用高速電動勻漿器將組織研磨成勻漿。為了降低研磨產(chǎn)生的熱量，使組織及酶不致變性，制備勻漿時一般應(yīng)將玻璃勻漿管插入冰水浴中，適當(dāng)控制研磨的速度。玻璃勻漿管是一種特制的厚壁毛玻璃管和一個一端帶有磨砂玻璃杵頭的研磨桿組成。規(guī)格大小不一，使用時可根據(jù)需要進(jìn)行選擇。 畢合生物（www.bihebio.com)提供服務(wù)內(nèi)容：分子生物學(xué)、免疫, 重組蛋白及ELISA相關(guān)、活性小分子化合物、高端化學(xué)、材料化學(xué)、細(xì)胞資源庫與培養(yǎng)相關(guān)、生命科學(xué)、天然產(chǎn)物 |
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