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科研顧問(wèn)_Gu新蟲(chóng) (小有名氣)
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干貨分享 | Q-PCR干粉引物，如何溶解？保存溫度和時(shí)間是多少？
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現(xiàn)代科研基本離不開(kāi)分子實(shí)驗(yàn)，分子實(shí)驗(yàn)又基本離不開(kāi)PCR，PCR肯定離不開(kāi)引物了，今天給小伙伴們討論收到引物的處理問(wèn)題。 QPCR 干粉引物溶解稀釋的一般方法如下： 收到引物后，在開(kāi)啟離心管蓋前，在3000-4000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速下離心1分鐘，以防開(kāi)蓋時(shí)引物干粉散失。因?yàn)橐镌诟稍镞^(guò)程中，寡核苷酸在EP管底部形成白色片狀沉淀。鑒于運(yùn)輸過(guò)程中沉淀會(huì)飄起，在打開(kāi)管蓋之前進(jìn)行簡(jiǎn)短離心這一步驟至關(guān)重要。 引物保存在高濃度的狀況下比較穩(wěn)定。如果對(duì)實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性要求較高，合成的 OD 數(shù)較大，建議分裝，避免反復(fù)凍融。 引物一般配制成10-100umol/l。 引物的濃度可以通過(guò)以下公式計(jì)算：引物終濃度（μM）=所需引物量（μg）/引物分子量（g/mol）/反應(yīng)體積（L）�？梢愿鶕�(jù)引物的OD值和分子量來(lái)計(jì)算需要加入多少液體才達(dá)到100μM的濃度，但沒(méi)必要學(xué)這個(gè)，一般公司都會(huì)直接給算好，在標(biāo)簽處標(biāo)明需要加入多少液體溶解以達(dá)到100μM的濃度。 用哪種溶劑溶解引物？ 如果需要稀釋引物，可以使用滅菌的去離子水或TE緩沖液（pH7.4-8.0）作為溶劑。其中，TE緩沖液比較穩(wěn)定，能提供穩(wěn)定的pH環(huán)境，適合于保存引物（以及質(zhì)�；蚧蚪MDNA），但也有人認(rèn)為，TE中的EDTA分子會(huì)影響后續(xù)PCR的效率。 引物的保存溫度和時(shí)間有什么限制？ 未溶解的引物在-20℃下可保存至少1年，溶解后的引物在-20℃下避免反復(fù)凍融，可以保存至少半年以上。如果對(duì)實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性要求較高，合成的OD值較大，建議將溶解好的引物事先稀釋為100μmol/L的儲(chǔ)存液，分裝數(shù)份保存于-20℃冰箱。使用前，將濃溶液稀釋成工作液（10pmol/μl或20pmol/μl）后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。 |
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