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基礎(chǔ)生物實(shí)驗(yàn)外?/a>新蟲(chóng) (初入文壇)
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脈絡(luò)膜新生血管動(dòng)物模型的構(gòu)建
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// 動(dòng)物的選擇 主要有鼠、兔和猴等。鼠是目前誘導(dǎo)CNV模型應(yīng)用最廣泛的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。 鼠 鼠誘導(dǎo)CNV的發(fā)生率較高，大約有60％～70％在光凝后短時(shí)間（1周）內(nèi)即可產(chǎn)生，而且光凝斑熒光滲漏10～14天達(dá)到高峰，便于進(jìn)行干預(yù)性研究；誘導(dǎo)CNV的條件也可標(biāo)準(zhǔn)化，價(jià)格相對(duì)便宜，便于基因操作，可用于觀察單一基因過(guò)表達(dá)或低表達(dá)對(duì)CNV生成的影響。 不足之處是FFA中觀察到的新生血管滲漏率低，僅為28％，且鼠的眼球較小，操作技術(shù)要求高。大鼠和小鼠CNV的誘發(fā)率無(wú)明顯差異，小鼠眼球更小，操作要求更高，更適于進(jìn)行有關(guān)基因敲除方面的研究。 猴 實(shí)驗(yàn)性猴CNV模型與人類(lèi)疾病改變極為相似，不僅組織學(xué)改變一致，在眼底熒光素血管造影（FFA）中也具有熒光素滲漏的特征。這種新生血管一般發(fā)生在激光光凝后4周，可持續(xù)2～52周。增生移行的RPE細(xì)胞包繞新生血管后，新生血管熒光素滲漏的表現(xiàn)會(huì)越來(lái)越不明顯。 盡管這種模型得到了一致的認(rèn)可，但動(dòng)物來(lái)源受限，費(fèi)用較高，CNV誘發(fā)時(shí)間較長(zhǎng)，發(fā)生率低，限制了其應(yīng)用。 兔 兔產(chǎn)生的CNV在FFA中不具有熒光素滲漏的特征，加之考慮到兔的眼底血循環(huán)結(jié)構(gòu)與人類(lèi)有較大的差異，目前已基本不用兔做此類(lèi)模型。 // 造模方法 一 激光誘導(dǎo)動(dòng)物模型 造模方法： 健康棕色挪威大鼠，雄性，體質(zhì)量180-200g，10%水合氯醛(0.35mL/100g體質(zhì)量)腹腔注射麻醉。復(fù)方托吡卡胺滴眼液點(diǎn)眼散瞳。眼前放置滴加少量 1%甲基纖維素的蓋玻片接觸角膜，氪激光(波長(zhǎng)647nm，光斑直徑50um，功率360mW，曝光時(shí)間0.05s)距視盤(pán)2~3個(gè)視盤(pán)直徑均勻光凝9個(gè)點(diǎn)，以見(jiàn)到有氣泡產(chǎn)生提示Bruch膜被擊穿為準(zhǔn)。 FFA的觀察： 光凝后第3、7、14、21、30d隨機(jī)選取4只大鼠行FFA檢查。散瞳及麻醉方法同前，10%熒光素鈉注射液0.5mL/kg腹腔注射后立即行FFA。FFA圖像符合以下特點(diǎn)即認(rèn)為CNV形成，①在造影早期即動(dòng)脈前期或動(dòng)脈期即顯影。②與視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)沒(méi)有聯(lián)系。③熒光素迅速滲漏，有一定的積存范圍，后期形成高熒光區(qū)。將各時(shí)間段出現(xiàn)CNV光凝斑數(shù)目與該時(shí)間段的光凝斑總數(shù)的比值作為該時(shí)段的CNV發(fā)生率。 后續(xù)進(jìn)行光鏡觀察、組織病理學(xué)CNV相對(duì)厚度測(cè)量、透射電鏡觀察。 優(yōu)點(diǎn)： 激光誘導(dǎo)的CNV動(dòng)物模型發(fā)生率較高，大約為 60%~70%，在光凝后短期時(shí)間（7d）內(nèi)即可產(chǎn)生，而且激光斑的熒光素滲漏在 10~14d達(dá)到高峰，便于進(jìn)行干預(yù)性研究；誘導(dǎo)CNV的條件也可標(biāo)準(zhǔn)化，價(jià)格相對(duì)便宜，是目前眼科誘導(dǎo)CNV最常用的動(dòng)物模型。 二 生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)CNV模型 包括視網(wǎng)膜下注射載有血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）基因的腺相關(guān)病毒載體、重組VEGF明膠微粒誘導(dǎo)CNV模型、視網(wǎng)膜下注射堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（basic fibroblastgrowth factor，bFGF）凝膠微粒誘導(dǎo)兔CNV模型、視網(wǎng)膜下注射bFGF/脂多糖誘導(dǎo)兔CNV模型、脈絡(luò)膜上腔植入bFGF微滲透泵誘導(dǎo)豬CNV模型等。其中視網(wǎng)膜下注射載有VEGF基因的腺相關(guān)病毒（adeno-associated virus，AAV）載體誘導(dǎo)CNV模型是較為理想的模型。 造模方法1： 將2μl編碼人 VEGF-A165腺病毒注射到大鼠視網(wǎng)膜下，CNV發(fā)生率為95%。 造模方法2： 在兔眼視網(wǎng)膜下注射5×106IU載有過(guò)表達(dá)VEGF-A165腺病毒載體誘導(dǎo)CNV模型，CNV發(fā)生率為83%。 三 轉(zhuǎn)基因或基因敲除誘導(dǎo) 轉(zhuǎn)基因和基因敲除建立CNV模型是一種新興技術(shù)，針對(duì)CNV發(fā)展的關(guān)鍵因素建立基因工程模型，可從不同角度分析各分子對(duì)CNV形成的影響，包括：（1）VEGF164RPE65轉(zhuǎn)基因小鼠；（2）雙倍體（Tet/VMD2/VEGF）和三倍體（Tet/VMD2/VEGF/An2）轉(zhuǎn)基因小鼠，視網(wǎng)膜可高表達(dá)VEGF，若同時(shí)視網(wǎng)膜下注射血管生成素2（angiogenin2，Ang2），能夠100%形成CNV；（3）趨化因子CC類(lèi)受體2（chemokine CC motif receptor 2，CCR2）/趨化因子CC類(lèi)配體2（chemokine CC motif ligand 2，CCL2）基因缺失誘導(dǎo)小鼠CNV模型，其成模率大約25％；（4）載脂蛋白E基因（apolipoprotein E，ApoE）過(guò)表達(dá)小鼠CNV模型是研究AMD病變中自發(fā)性CNV形成機(jī)制的重要模型；（5）CCL2和CX3C趨化因子受體1（CX3C chemokine receptor 1，CX3CR1）基因缺陷小鼠；（6）超氧化物歧化酶1（superoxide dismutase 1，SOD1）基因缺陷老化小鼠；（7）極低密度脂蛋白受體（very low density lipoprotein receptor，VLDLR）定向突變小鼠；（8）視紫紅質(zhì)基因啟動(dòng)子/VEGF過(guò)表達(dá)小鼠。 優(yōu)缺點(diǎn)： 轉(zhuǎn)基因或基因敲除誘導(dǎo)的CNV模型具有誘導(dǎo)快，發(fā)生時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)，與CNV病理生理學(xué)關(guān)聯(lián)性強(qiáng)，對(duì)CNV發(fā)生機(jī)制的研究具有針對(duì)性，同時(shí)研究者可根據(jù)不同需求選擇模型并修改參數(shù)；缺點(diǎn)有CNV誘導(dǎo)率低、面積小、價(jià)格貴等問(wèn)題。 // 總結(jié) 在眾多建立CNV模型的方法中，激光誘導(dǎo)CNV模型條件較成熟，研究歷史久，可靠性高，應(yīng)用廣泛。由于動(dòng)物體內(nèi)環(huán)境不同于人體內(nèi)環(huán)境，各種方法誘導(dǎo)的CNV動(dòng)物模型也僅能模擬人類(lèi)CNV，不能完全代替人類(lèi)CNV發(fā)展的自然過(guò)程，因此，研究結(jié)果僅能為CNV發(fā)病和機(jī)制研究提供實(shí)驗(yàn)理論依據(jù)。 |
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