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科研顧問_Gu新蟲 (小有名氣)
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干貨分享 | 此FISH非彼FISH，這是熒光原位雜交技術(shù)
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一．FISH的定義 熒光原位雜交技術(shù)（FISH）是一種利用熒光信號檢測探針的原位雜交技術(shù)[1]。它將熒光信號的高靈敏度、安全性及直觀性和原位雜交的高特異性結(jié)合起來，通過熒光標記的核酸探針與待測樣本核酸進行原位雜交。在熒光顯微鏡下對熒光信號進行辨別和計數(shù)，從而對染色體或基因異常的細胞和組織樣本進行檢測和診斷，為各種基因相關(guān)疾病的分型、預前和預后提供準確的依據(jù)。FISH染色結(jié)果如圖1.1所示。 二．FISH的原理 FISH分為直接法和間接法。 直接法是在已知堿基序列的核酸探針上標記熒光素，在組織切片、間期細胞及染色體標本上與靶核酸進行原位雜交。因所形成的雜交體帶有熒光素。故可在熒光顯微鏡下直接觀察。 間接法使用非熒光物質(zhì)標記的核酸探針。如生物素或地高辛等標記探針，再通過親和連接或免疫反應帶入熒光物質(zhì)來檢測雜交體的存在。 廣義上講，F(xiàn)ISH靶序列可以是DNA或RNA，既可以用來進行基因組層面的研究，也可以進行表達層面的研究[1]。 目前常用的熒光素有異硫氰酸熒光素、得克薩斯紅、羅丹明及其衍生物四甲基異硫氰酸羅丹明等[3]。 三．FISH的發(fā)展 熒光原位雜交技術(shù)是在同位素原位雜交技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。1969年Gall和Pardue及John等分別獨立建立了同位素原位雜交技術(shù)。1974年Evans第一次將染色體顯帶技術(shù)和原位雜交技術(shù)結(jié)合起來，提高了基因定位的準確性。1975年，Manning等人最先在溶液的分子雜交中，使用非放射性標記，通過細胞色素C將生物素與RNA分子連接起來。1977年Rudkin等發(fā)明了用間接免疫熒光法檢測目的DNA的非同位素原位雜交技術(shù)。1981年Bauman首次報道了采用熒光素標記的探針在細胞制片上進行基因原位雜交，建立了非放射性原位雜交技術(shù)[4, 5]。 FISH技術(shù)發(fā)展至今已40多年，一直是細胞學研究的重要手段[6]。自1990年以來，F(xiàn)ISH在方法上形成了從一種顏色到多種顏色、從中期染色體FISH到粗線染色體FISH再到纖維-FISH的發(fā)展趨勢，并且隨著物理、化學技術(shù)的發(fā)展與進步，免疫染色、量子點和微流控芯片等不斷被引入到熒光原位雜交中，促進了熒光原位雜交技術(shù)和分子細胞遺傳學的發(fā)展[7, 8]。 目前熒光原位雜交技術(shù)因其安全、準確、方便、實用等優(yōu)點得到了廣泛的關(guān)注及應用。 四．FISH的應用 熒光原位雜交技術(shù)在腫瘤診斷中的應用 腫瘤已經(jīng)成為現(xiàn)代人類死亡的主要原因之一，腫瘤的提前確診對治療有著極大的幫助。過去診斷細胞樣本中是否含有腫瘤細胞主要用巴氏染色法等一些細胞化學染色法。新涌現(xiàn)的輔助診斷技術(shù)相比過去的方法更快捷簡單，熒光原位雜交技術(shù)就是其中之一[4]。 （1）血液腫瘤學 臨床上對血液腫瘤的FISH檢測主要集中在：染色體異位形成的融合基因的檢測；基因缺失檢測可以發(fā)現(xiàn)一些關(guān)鍵基因的缺失，有助于疾病的診斷及預后判斷；使用熒光原位雜交技術(shù)可對微小殘留病灶進行檢測，以及進行造血干細胞移植狀態(tài)的監(jiān)測。 （2）實體腫瘤學 目前應用于臨床的檢測基因突變方法以NGS和PCR為主。與FISH相比，NGS對實驗室要求高，同時存在檢測周期長和檢測費用高等問題；熒光PCR只能夠通過標準曲線和標準品進行相對定量，無法做到絕對定量，數(shù)字PCR的檢測系統(tǒng)成本高，通量有限，操作繁瑣，也不能在細胞水平上觀察到基因突變的狀態(tài)，不具備定位的功能。FISH技術(shù)可以在間期細胞核上找到DNA擴增的直接證據(jù)，而且間期細胞核所顯示出的擴增DNA熒光信號的數(shù)量多少及熒光強度常與DNA擴增的水平有關(guān)。 FISH被廣泛應用于乳腺癌、膀胱癌，宮頸癌，肺癌和淋巴癌等實體腫瘤的輔助診斷。目前，F(xiàn)ISH主要集中用于對腫瘤的早期診斷、療效檢測，個體化治療和預后判斷等方面[9]。 熒光原位雜交技術(shù)在基因定位中的應用 基因定位是熒光原位雜交的最基礎(chǔ)最成功的應用。利用熒光原位雜交靈敏、準確，并且可以一次檢測多段基因等特點，可以確定目標基因的準確位置，確定幾個基因之間的位置關(guān)系，以及基因與染色體端粒之間的關(guān)系，基因與著絲點的關(guān)系，是構(gòu)建基因圖譜的基本要素。目前熒光原位雜交技術(shù)被廣泛地應用于基因的物理定位及基因圖譜的繪制[4]。 熒光原位雜交技術(shù)在產(chǎn)前檢查中的應用 產(chǎn)前診斷是優(yōu)生優(yōu)育的重要保障。染色體異常是評價重大出生缺陷性疾病的重要指標。最常見的染色體異常是染色體數(shù)目異常，可能引發(fā)死胎、流產(chǎn)，即使存活也會使患病兒童畸形、生長緩慢、智力低下等。利用熒光原位雜交技術(shù)可以檢測染色體非整倍體的特點，采集孕婦羊水，對未培養(yǎng)的羊水間期細胞進行檢測，確定其是否為非整倍體，對胎兒染色體異常疾病進行診斷，使產(chǎn)前診斷時間縮短至24～48 h。熒光原位雜交的實驗技術(shù)和探針的不斷改進，應用熒光原位雜交方法進行產(chǎn)前診斷對一些重大染色體異常引起的疾病確診率已經(jīng)達到99%，相較于傳統(tǒng)診斷方法更快捷，能夠減少孕婦等待的痛苦[4]。 五．FISH診斷的優(yōu)勢 FISH診斷的優(yōu)勢主要體現(xiàn)在經(jīng)濟安全、檢測速度快、操作簡便、靈敏度高和特異性強等方面。 在非小細胞肺癌治療中，靶向治療是非常有效的一種新的治療方法，提高了腫瘤的治愈率。其中，表皮生長因子受體（EGFR）作為非小細胞肺癌分子靶向治療的靶標，酪氨酸激酶抑制劑能夠?qū)GFR基因變異的癌細胞的生長進行抑制。所以，對EGFR基因突變進行檢測非常重要，可以為非小細胞肺癌的治療方案和預后判定提供重要信息[10]。 參考文獻： [1]. 熒光原位雜交技術(shù)-百度文庫 [2]. 陳正啟. 全自動熒光原位雜交系統(tǒng)裝置的研究與開發(fā)[D].武漢紡織大學,2020.DOI:10.27698/d.cnki.gwhxj.2020.000048. [3]. https://www.360doc.com/content/14/0915/15/5514788_409659718.shtml [4]. 張淼,陳瑛,吳憶寧等.熒光原位雜交技術(shù)的應用進展[J].哈爾濱師范大學自然科學學報,2014,30(06):90-93. [5]. 佘尚揚.熒光原位雜交技術(shù)的研究進展和應用[J].中國現(xiàn)代藥物應用,2011,5(14):129-131.DOI:10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2011.14.018. [6]. 姜春秀,姚偉,張木清等.新型寡聚核苷酸熒光原位雜交：發(fā)展與應用[J].植物遺傳資源學報,2023,24(02):349-356.DOI:10.13430/j.cnki.jpgr.20220801001. [7]. 何世斌,柴連琴,譚珺雋等.熒光原位雜交技術(shù)的研究進展[J].植物科學學報,2014,32(02):199-204. [8]. 錢文丹,陳波利.熒光原位雜交技術(shù)及其應用[J].鄉(xiāng)村科技,2018,No.193(25):51-52.DOI:10.19345/j.cnki.1674-7909.2018.25.030. [9]. 溫旺榮, 周華友主編,臨床分子診斷學 第2版,廣東科技出版社,2015.04,第72-75頁 [10]. 侯舒倩.熒光原位雜交與免疫組化技術(shù)在非小細胞肺癌中的應用比較[J].黑龍江醫(yī)學,2019,43(02):160-161+164. |
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