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實驗技巧 | 7種較常見的流式疑難問題解析
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1. 無信號/熒光強度弱 信號補償不正確 檢查流式細胞儀上單色陽性對照是否設置正確，以及門控和補償設置是否正確，確保您能捕獲所有事件。 用于檢測的抗體不足 增加抗體量或抗體濃度。 無法接近細胞內靶標 檢查靶蛋白是否是位于細胞內，或者膜蛋白的抗體表位是否位于細胞內。關于細胞內染色，確保充分透化。為防止細胞表面蛋白質發(fā)生內化，所有操作步驟必須在冰上或 4℃ 下用預冷的交聯試劑完成，以阻止所有細胞反應。 在實驗試劑中添加疊氮化鈉可阻止表面抗原的調變和內化，但會導致熒光強度損失。對于粘附細胞系的染色，胰蛋白酶通�？梢哉T使細胞表面蛋白發(fā)生內化，并且可能需要更溫和的分離方法。 細胞內染色 - 熒光染料結合分子太大 細胞內染色實驗應使用小分子量的熒光染料。分子量大的熒光染料會降低抗體活性，阻止抗體進入細胞標記目標蛋白。 激光器未對齊 確保流式細胞儀上的激光器正確對齊，必要時通過運行液流檢查微珠來調整路線。如果激光器未正確對齊或發(fā)生偏移，則可能需要考慮維修機器。 靶蛋白不存在/低水平表達 確保您正在分析的組織/細胞類型能表達靶蛋白，并且靶蛋白的量足以被檢出。 可溶性/分泌性靶蛋白 靶蛋白是否可溶并由細胞分泌？靶蛋白需要嵌合在細胞膜上或存在于細胞質里，以便輕松通過流式細胞術檢出。通過高爾基體封閉步驟，例如加入 Brefeldin A，可以改善細胞內的染色信號。 補償過高/增益過低 使用陽性對照正確設置流式細胞儀，利用補償確保細胞的熒光信號不被切斷，提高增益以增強信號（在合理范圍內 - 應謹慎操作）。 熒光染料的熒光消退 抗體可能存放太久或沒有避光。需要新鮮抗體。 一抗和二抗不匹配 使用的二抗應與一抗來源種屬不同（例如，一抗為兔源，則應該使用抗兔源二抗）。為了解決種屬交叉反應性的問題，您可以使用經流式細胞術驗證的直接偶聯一抗，或者使用偶聯物試劑盒，在您選擇的抗體中加入合適的熒光染料。 2. 熒光強度高 抗體濃度過高 會導致強非特異性結合或高熒光強度。減少每個樣本中添加的抗體量。 過量抗體被捕獲 可能是胞內染色特有的問題，這種情況下，抗體上的大熒光染料分子可能被捕獲在細胞內。確保洗滌步驟充分，并在洗滌緩沖液中加入吐溫或Triton，以保持細胞的透化作用。 封閉不足 在您的抗體混合液中加入1%-3%封閉劑，并增加封閉步驟。 3. 背景高/陽性細胞百分比高 增益設置過高/補償過低 使用陽性對照正確設置流式細胞儀，使用補償減少小顆粒背景信號并減少增益，以降低信號。 抗體過量 降低抗體濃度。還可以在洗滌緩沖液中添加去污劑，確保洗去過量的抗體。 4. 在應該只有一個細胞群的情況下觀察到兩個或多個細胞群 表達靶蛋白的細胞群不止一個 檢查樣本包含的細胞類型的預期蛋白表達水平，如有必要，確保細胞充分分離。 出現細胞雙峰 細胞雙峰顯示為第二大細胞群，其熒光強度大約是單細胞熒光強度的兩倍。染色前用移液槍將細胞輕柔混勻，放入細胞儀中運行前再次混勻。也可以篩選或過濾細胞，以去除團塊（30μL尼龍網）。 5. 側向散射背景偏高（來自小顆粒） 細胞裂解 確保樣本中的細胞沒有裂解和破碎。樣本應新鮮，并正確制備。不要在高轉速的情況下對細胞進行離心或激烈渦旋。 細菌污染 確保樣本不受污染。細菌會自動發(fā)出較弱的熒光，導致高事件率。 6. 低事件率 每毫升的細胞數過少 運行1×106個細胞/mL。確保細胞混合均勻（輕柔混勻）。 細胞聚集，阻塞管道 染色前輕輕吹打幾次，確保得到同源單細胞懸液。確保上機前再次混勻。極端情況下，可以篩選或過濾細胞，以去除團塊（300目尼龍網）。 7. 高事件率 細胞數量過多 稀釋至1×105至1×106個細胞/mL。 |
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