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科研戰(zhàn)神·王鐵蟲 (小有名氣)
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[交流]
PCR檢測技術(shù)操作步驟
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分子生物學(xué)：PCR檢測技術(shù)操作步驟 聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR)是利用一段DNA為模板，在DNA聚合酶和核苷酸底物共同參與下，將該段DNA擴(kuò)增至足夠數(shù)量，以便進(jìn)行結(jié)構(gòu)和功能分析。PCR檢測方法在臨床上快速診斷細(xì)菌性傳染病等方面具有極為重要的意義。 簡單來說分為以下三個(gè)步驟： DNA變性，加熱使靶DNA序列雙鏈解離成單鏈DNA。 引物與靶DNA退火，適當(dāng)降低溫度，使兩個(gè)引物分別結(jié)合成靶DNA兩條的3′末端向5′末端延伸。 引物延伸，在DNA聚合酶的催化下，引物沿著靶DNA3′末端向5′末端延伸。新合成的DNA鏈在變性解離后，又可作為模板與引物雜交，并且在DNA聚合酶的催化下，引導(dǎo)合成新的靶DNA鏈。如此反復(fù)進(jìn)行以上3個(gè)步驟，即可使靶DNA片段指數(shù)性擴(kuò)增。 具體操作步驟如下： 1.在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。 10×PCR buffer 5 μl dNTP mix （2mM） 4 μl 引物1（10pM） 2 μl 引物2（10pM） 2 μl Taq酶 （2U/μl） 1 μl DNA模板（50ng-1μg/μl） 1 μl 加ddH2O至 50 μl 視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。 2.調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，最后在72℃ 保溫7min。 3.結(jié)束反應(yīng)。PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。 4.PCR的電泳檢測：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μl氯仿進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。 雖然，PCR技術(shù)已經(jīng)相當(dāng)成熟，但對(duì)于一個(gè)傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室，不但要滿足高科技的實(shí)驗(yàn)設(shè)備，合理的空間布局等基本條件，一般還具有人員素質(zhì)專業(yè)性高、管理嚴(yán)謹(jǐn)度高、投入成本高、結(jié)果責(zé)任性高等特點(diǎn)。 |
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