 |
 |
 |
 |
 |
 |
||
 |
 |
 |
 |
 |
| 2 | 1/1 | 返回列表 |
| 查看: 704 | 回復: 1 | |||
科研戰(zhàn)神·王鐵蟲 (小有名氣)
|
[交流]
蛋白實驗 | 免疫共沉淀 已有1人參與
|
|
蛋白實驗 | 免疫共沉淀 免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，Co-IP）是一種利用抗原與抗體之間的專一性為基礎，廣泛應用于研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典研究方法。 原理 如果細胞內(nèi)兩蛋白（A、B）有直接或間接的相互作用時，那么在溫和的裂解條件下獲得的蛋白樣品中加入 A 蛋白的抗體將A蛋白沉淀下來，在細胞內(nèi)與A蛋白直接相互作用的B蛋白或與其間接相互作用的C蛋白能一起被沉淀下來。使用western blot檢測沉淀中是否存在B或C蛋白來確定B或C蛋白與A蛋白的相互作用。 用途 1、檢測A、B蛋白在體內(nèi)是否相互結(jié)合 2、分離與A蛋白相互作用的蛋白復合物 優(yōu)缺點 優(yōu)點： （1）相互作用的蛋白質(zhì)都是經(jīng)翻譯后修飾的，處于天然狀態(tài)； （2）蛋白的相互作用是在自然狀態(tài)下進行的，可以避免人為的影響； （3）可以分離得到天然狀態(tài)的相互作用蛋白復合物。 缺點： （1）可能檢測不到低親和力和瞬間的蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用； （2）兩種蛋白質(zhì)的結(jié)合可能不是直接結(jié)合，而可能有第三者在中間起橋梁作用； （3）必須在實驗前預測目的蛋白是什么，以選擇最后檢測的抗體，所以，若預測不正確，實驗就得不到結(jié)果，方法本身具有冒險性。 步驟 一 細胞的鋪板與轉(zhuǎn)染 1、提前一晚將293T細胞鋪板至6 cm皿中，鋪板量以達到相應的轉(zhuǎn)染試劑要求為準； 2、用各實驗室相應的轉(zhuǎn)染試劑將以下質(zhì)粒組合轉(zhuǎn)染兩皿細胞：flag 空載+HA-B；flag-A+HA-B；每質(zhì)粒2微克。 二 免疫沉淀 1、轉(zhuǎn)染24小時后，收獲細胞，每皿加入500 μL裂解液，收集細胞至1.5 mL EP 管中，在冰上超聲破碎細胞； 2、超聲好后，4℃，12,000 g，離心30分鐘，取400 μL上清液用于免疫沉淀，80 μL上清用作總蛋白并加入等體積的2Ⅹ loading buffer； 3、將400 μL上清加入用裂解液清洗了3遍的beads中，加入0.3-0.5 μg flag抗體，4℃孵育 3-4 小時； 4、4℃，2,000 rpm，離心3分鐘，去除未結(jié)合的液體，留下beads沉淀，用預冷的蛋白裂解液清洗沉淀3次，每次5分鐘； 4、最后一次去除清洗液，往沉淀中加入60 μL 2Ⅹ loading buffer，和總蛋白一起在沸水中煮沸 15 分鐘。 三 Western Blot 檢測 通過 SDS-PAGE 分離樣品，利用全蛋白樣品作為對照，檢測flag-A和HA-B蛋白是否發(fā)生結(jié)合。 注意事項 1、對于內(nèi)源的Co-IP檢測應該用10cm皿來培養(yǎng)目的細胞，并維持較好的生長狀態(tài)； 2、如果該實驗用于新蛋白的鑒定，應注意抗體重鏈和輕鏈的影響； 3、該實驗不能確定蛋白之間的相互作用是直接還是間接的。 |
回復此樓» 猜你喜歡
歡迎211本科同學，過A區(qū)國家線，A區(qū)非偏遠一本，交叉學科課題組
已經(jīng)有24人回復
-
新疆大學地質(zhì)與礦業(yè)工程學院招生
已經(jīng)有10人回復
-
招調(diào)劑
已經(jīng)有11人回復
-
0856材料與化工求調(diào)劑！
已經(jīng)有11人回復
-
材料與化工304求調(diào)劑
已經(jīng)有10人回復
-
A區(qū)一本交叉課題組，低分調(diào)劑，招收機械電子信息通信等交叉方向
已經(jīng)有31人回復
-
中科大材料299求調(diào)劑
已經(jīng)有7人回復
-
301求調(diào)劑
已經(jīng)有3人回復
-
材料考研339求調(diào)劑
已經(jīng)有3人回復
-
材料專碩290求調(diào)劑
已經(jīng)有5人回復
» 本主題相關(guān)商家推薦: (我也要在這里推廣)
長歌懷采薇2024
新蟲 (初入文壇)
- 應助: 0 (幼兒園)
- 金幣: 13.5
- 帖子: 4
- 在線: 39分鐘
- 蟲號: 35380601
- 注冊: 2024-04-18
- 專業(yè): 蛋白質(zhì)組學
2樓2024-04-19 01:03:31
相關(guān)版塊跳轉(zhuǎn)
我要訂閱樓主 科研戰(zhàn)神·王 的主題更新
| 2 | 1/1 | 返回列表 |
| 最具人氣熱帖推薦 [查看全部] | 作者 | 回/看 | 最后發(fā)表 | |
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 新疆大學地質(zhì)與礦業(yè)工程學院招生 +5 | another12 2026-03-04 | 10/500 |
|
|---|---|---|---|---|
|
|
[考研] 0856材料與化工求調(diào)劑！ +5 | 化工考生111 2026-03-04 | 11/550 |
|
|
|
[考研] 中科大材料299求調(diào)劑 +5 | DAIjiayo 2026-03-05 | 7/350 |
|
|
[考研] 303求調(diào)劑 +3 | forgman95 2026-03-05 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 材料277分求調(diào)劑 +11 | 飯飯星球 2026-03-04 | 11/550 |
|
|
|
[考研] 【求調(diào)劑】293分環(huán)境工程求調(diào)劑材料/化工，服從調(diào)劑，抗壓能力強！ +8 | xiiiia 2026-03-04 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 求材料調(diào)劑 +4 | berdmond 2026-03-05 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 化學專業(yè)調(diào)劑 +3 | 好好好1233 2026-03-04 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 一志愿985材料與化工 326分求調(diào)劑 +3 | Hz795795 2026-03-04 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 求調(diào)劑 +7 | 博斯特525 2026-03-04 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 295求調(diào)劑 +4 | 小賽不吃香菜 2026-03-04 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 材料工程269求調(diào)劑 +7 | 白刺玫 2026-03-02 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 環(huán)境工程學碩288求助調(diào)劑 +7 | 多吃億口芝士 2026-03-02 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 085700資環(huán)求調(diào)劑，初始279，六級已過，英語能力強 +3 | 085700資環(huán)調(diào)劑 2026-03-03 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 292求調(diào)劑 +3 | sgbl 2026-03-03 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 0805總分292，求調(diào)劑 +12 | 幻想之殤 2026-03-01 | 12/600 |
|
|
|
[考研] 298求調(diào)劑 +7 | axyz3 2026-02-28 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 288求調(diào)劑 +3 | 少71.8 2026-03-02 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 材料085601調(diào)劑 +5 | 多多子. 2026-03-02 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 一志愿東北大學材料專碩328，求調(diào)劑 +3 | shs1083 2026-03-02 | 3/150 |
|