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18317190548新蟲 (小有名氣)
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[交流]
類器官+CRISPR 篩選：強大的疾病建模工具！ | MedChemExpress
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類器官研究，近年來深受基金申請和高分雜志的青睞。之前，小 M 也已為大家介紹過類器官 + CRISPR 的研究。今天，小 M 針對 Cell Stem Cell 發(fā)表的相關(guān)研究，并附文獻操作指南，助力您的實驗設(shè)計！ 結(jié)直腸癌 (Colorectal cancer, CRC) 是男性和女性中第三大最常見的新診斷癌癥類型，其特點是患者之間存在顯著的遺傳和表型異質(zhì)性。雖然外顯子組測序有助于復(fù)發(fā)性遺傳病變的識別，但檢測頻率較低。 為了促進腫瘤驅(qū)動因素的高通量基因測試和功能鑒定，Michels BE 等人開發(fā)了一個在人類結(jié)腸類器官中進行 CRISPR-Cas9 聯(lián)合篩選的平臺，使得利用類器官進行體外和體內(nèi)移植后腫瘤抑制基因的篩選鑒定成為可能[2]。 基于類器官的 CRISPR-Cas9 聯(lián)合篩選的平臺[2]。 首先，作者通過藥篩系統(tǒng)將攜帶 Cas9 蛋白的慢病毒載體轉(zhuǎn)入結(jié)腸類器官,建立了穩(wěn)定表達 Cas9 的人結(jié)腸類器官培養(yǎng)體系。正常人結(jié)腸類器官對轉(zhuǎn)化生長因子-β (TGF-β) 敏感，在培養(yǎng)體系中添加 TGF-β 可以有效殺死類器官，而敲除 TGF-B 的受體基因 (TGFBR) ，即用針對 TGFBR2 的慢病毒 gRNA 轉(zhuǎn)導則可以挽救 TGF-β 導致的細胞毒性。 圖 1. 穩(wěn)定表達 Cas9 的結(jié)腸類器官的組織形態(tài)學[2]。 在對照培養(yǎng)基中（左）以及在對照 gRNA（中）或 TGFBR2 gRNA 慢病毒（右）存在下進行 TGF-β 選擇 3 周后穩(wěn)定表達 Cas9 的類器官的形態(tài)學。 【參考操作】[2]： （一）類器官的培養(yǎng)： 1.完全培養(yǎng)基:含DMEM/F12，10 mM HEPES, 1x Glutamax, 1x penicillin/streptomycin, 2% B27, 1mM Nicotinamide, 12.5 mM N-Acetylcysteine, 500 nM A83-01, 10 mM SB202190, 50% Wnt3a, 20% R-spondin-1, 10% Noggin、50 ng/mL human EGF。 2. 類器官培養(yǎng)基每 2-3 天更換一次，每周傳代一次，并在 Rho 激酶抑制劑 Y-27632 (10 mM) 的存在下培養(yǎng)在基底膜基質(zhì)膠中。 （二）類器官的轉(zhuǎn)染： 1. 通過移液多次機械分散類器官，然后進行 Accutase 消化以獲得單細胞。 2. 洗滌后，將細胞重懸于含有 Rho 激酶抑制劑 (10 μM) 和 Polybrene(8 μg/mL) 的培養(yǎng)基中，并進行旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)染 (500*g，1 小時，32°C)。 3. 37°C 孵育 3-5 小時后，將細胞接種到 Matrigel 中。轉(zhuǎn)染后 2 天開始選擇。 隨后，作者設(shè)計了針對 TGF-β 通路的 6 個關(guān)鍵組分 (圖 2A) 和 94 個對照基因。每個基因都被 20 個獨立的 gRNA 靶向，整個文庫包含 2,200 個 gRNA，并被轉(zhuǎn)導到穩(wěn)定表達 Cas9 的正常人結(jié)腸類器官中 (圖 2 B)。以混合方式提取基因組DNA，并通過 NGS 分析慢病毒條形碼。針對 TGFBR1 和 TGFBR2 的單個 gRNA 富集程度最高，證實了篩選系統(tǒng)的有效。 圖 2. 使用 TGF-β 耐藥性訓練庫進行類器官篩選[2]。 接著，作者對異種移植類器官中的腫瘤抑制功能進行體內(nèi)篩選。作者構(gòu)建了一種預(yù)致瘤類器官系，AK 類器官 (APC-KO/KRASGG12D)，即缺失 APC 和致癌 KRASG12D 等位基因的結(jié)腸類器官。其僅在敲除 TGFBR2 (AKT 類器官) 后才顯示出生長。 圖3. 腫瘤抑制功能可移植類器官模型的開發(fā)[2]。 【參考操作】[2]： （一）AK（APC−/−，KRASG12D）類器官： 1. AK (APC−/−, KRASG12D) 類器官按照使用 WT 類器官的描述生成。該類器官用含有 Cas9 和 APC gRNA 的 lentiCRISPR v2 轉(zhuǎn)導，并在連續(xù)嘌呤霉素選擇 (0.5 μg/μL)，不含 Wnt、Rspondin 的情況下培養(yǎng)。 2. 分離、擴增單個克隆，并通過 Sanger 測序證實 APC 突變。 3. KRASG12D 是通過將 KRAS gRNA 與單鏈修復(fù)模板一起瞬時共轉(zhuǎn)染到質(zhì)粒 gRNA_GFP-T2 中而引入的。在不含 Wnt、Rspondin 和 EGF 且添加 0.5-1.0 mM EGFR 抑制劑的培養(yǎng)基中選擇類器官。 4. 擴增克隆系，并通過 Sanger 測序證實 KRASG12D 突變。 （二）AKT 類器官： 通過慢病毒 gRNA 將 TGFBR2-KO 引入 AK 類器官中，然后在缺乏 TGF-β 抑制劑 (A83-01) 且補充有 5 ng/mL 重組人 TGF-β 的培養(yǎng)基中進行選擇，然后通過 Sanger 測序進行確認。 作者設(shè)計了一個泛癌 TSG gRNA 庫，其中包含先前研究中發(fā)現(xiàn)的 85 個 TSG。對于每個靶標，設(shè)計了 20 個獨立的 gRNA，包括對照在內(nèi)，整個文庫包含 2,600 個 gRNA。轉(zhuǎn)導后，AK 類器官注射移植到 8-10 只 NSG 小鼠皮下（圖 4)。11 至 12 周后，匯集所有腫瘤的基因組 DNA，并在 3 個實驗重復(fù)中進行篩選，通過檢測 sgRNA 序列的富集情況來判斷發(fā)生突變的功能因子。篩選結(jié)果顯示, TGFBR2是所有三個重復(fù)中富集度最高的 gRNA，表明 TGF-β 在腫瘤微環(huán)境中具有主導的生長抑制作用。提示該篩選體系可以有效的進行腫瘤抑制因子的體內(nèi)篩選。 圖 4. 移植人體類器官中腫瘤抑制功能的體內(nèi)文庫篩選[2]。 此外，也有一些針對非功能基因的 gRNA 被富集，表明存在假陽性。作者通過在sgRNA 載體引入 UMI (unique molecular identifiers) 的方式，顯著提高了篩選的準確性，降低了假陽性率。該方法體系還可以擴展到結(jié)腸以外其它上皮細胞的篩選,將來可能用于個性化的腫瘤治療。 看了這么多，相信大家對類器官的培養(yǎng)方法有了大概的了解。MCE 現(xiàn)已推出類器官相關(guān)產(chǎn)品 55 折活動，截止到 2024.04.30，心動不如行動，來 MCE 官網(wǎng)查詢具體的產(chǎn)品信息吧！ MCE 的所有產(chǎn)品僅用作科學研究或藥證申報，我們不為任何個人用途提供產(chǎn)品和服務(wù)。 參考文獻： [1] Zhu Y. Advances in CRISPR/Cas9. Biomed Res Int. 2022 Sep 23;2022:9978571. [2] Michels BE, et al. Pooled In Vitro and In Vivo CRISPR-Cas9 Screening Identifies Tumor Suppressors in Human Colon Organoids. Cell Stem Cell. 2020 May 7;26(5):782-792.e7. |
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