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科研狗的日常吖新蟲 (初入文壇)
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[交流]
實驗技能分享|載體構(gòu)建及原核表達
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01實驗?zāi)康?br />
基因表達是生物學(xué)研究中的重要內(nèi)容之一，而基因表達載體則是基因表達研究中不可或缺的工具�；虮磉_載體是一種能夠?qū)⑼庠椿驅(qū)氲郊毎胁⑹蛊浔磉_的DNA分子。在細胞內(nèi)，基因表達載體可以通過轉(zhuǎn)錄和翻譯的過程將外源基因轉(zhuǎn)化為蛋白質(zhì)，從而實現(xiàn)基因表達。 02實驗原理 表達載體是用來在受體細胞中表達外源基因的載體，原核表達載體通常為質(zhì)粒，表達載體除具有克隆載體所具有的性質(zhì)以外，還應(yīng)具有表達元件（轉(zhuǎn)錄和翻譯所必須的DNA序列）。 大腸桿菌表達載體要求：①有一個強的啟動子及其兩側(cè)的調(diào)控序列；②應(yīng)有SD序列，且SD序列與起始密碼子ATG之間要有合適的距離；③在克隆基因與啟動子之間有正確的閱讀框架；④外源基因下游應(yīng)加入不依賴ρ因子的轉(zhuǎn)錄終止區(qū)。 構(gòu)建好表達載體之后，提取重組載體的質(zhì)粒，然后用質(zhì)粒進行表達宿主菌的轉(zhuǎn)化。 03實驗步驟 1.目的片段的獲取 1.1 引物設(shè)計 在NCBI上查找目的基因SD序列，使用Primer 5軟件進行引物的設(shè)計，在設(shè)計引物時須引入合適的酶切位點和保護性堿基 感受態(tài)細胞（和轉(zhuǎn)化Top10同理）； b.挑取單菌落接種至含抗性（與載體上抗性基因一致）的液體LB培養(yǎng)瓶中，置于搖床上37 ℃ 220 rpm培養(yǎng)過夜； c.將過夜培養(yǎng)的菌液以1:100的比例接種于含抗性（與載體上抗性基因一致）的液體LB培養(yǎng)瓶中擴大培養(yǎng)； d.待OD600=0.6-0.8時，取1mL菌液作為未誘導(dǎo)全菌樣品對比，并向剩余菌液中加入終濃度為0.5 mM的IPTG，置于搖床上低溫180 rpm誘導(dǎo)過夜。 3.3 超聲破碎菌液 a.從過夜誘導(dǎo)后的菌液中取1mL作為誘導(dǎo)后全菌樣品對比，收集剩余菌液離心（8000 rpm，20 min，4℃）棄上清用PBS重懸濃縮（濃縮比例約10:1）； b.超聲破碎（超聲4 s，停歇7 s）至透亮，結(jié)束后離心（10000 rpm，30min，4℃）分別收集上清和沉淀，將其作對照組取樣； c.取誘導(dǎo)前全菌，誘導(dǎo)后全菌，誘導(dǎo)后上清，誘導(dǎo)后沉淀各40μL，加入10 μL 5×loading buffer，于99℃變性20min，進行SDS-PAGE電泳分析。 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
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