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層析技術(shù):生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)常用技術(shù)
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層析技術(shù)是近代生物化學(xué)最常用的分離技術(shù)之一。它是利用混合物中各組分的理化性質(zhì)(吸附力、分子形狀和大小、分子極性、分子親和力、分配系數(shù)等)的差異,在物質(zhì)經(jīng)過(guò)兩相中,不斷地進(jìn)行交換、分配等過(guò)程。任何層系都具有兩個(gè)相,即固定相和流動(dòng)相。固定相固定不動(dòng),流動(dòng)相對(duì)固定相作單相的相對(duì)運(yùn)動(dòng),從而推動(dòng)樣品中各組分通過(guò)固定相向前移動(dòng)。由于混合物中各組分的理化性質(zhì)不同,對(duì)流動(dòng)相和固定相具有不同的作用力,因此在流動(dòng)相推動(dòng)樣品通過(guò)固定相的過(guò)程中,通過(guò)不斷的吸附-解吸-吸附-解吸作用,造成混合物中各組分距離不等的遷移,從而達(dá)到分離的目的。層析技術(shù)的分類(lèi)方法有多種。根據(jù)兩組分所處的物理狀態(tài)可分為:氣相層析和液相層析。氣相層析指的是流動(dòng)相為氣體,固定相可以是液體(氣液層析)也可以是固體(氣固層析);液相層析指的是流動(dòng)相為液體,固定相可以是液體(液液層析)也可以固體(液固層)。根據(jù)層析的方式可分為:紙層析、薄層層析和柱層析。紙層析指的是濾紙作固定相進(jìn)行的層析;薄層層析是將固定相研成粉末,再壓成薄膜或薄板,類(lèi)似于紙層析;柱層析是將固定相裝于柱內(nèi)的層析。根據(jù)層析的原理可分為:吸附層析、分配層析、離子交換層析、凝膠層析和親和層析。下面根據(jù)層析的原理,依次介紹這些層析。 一、吸附層析一、基本原理任何兩個(gè)相都可以形成表面,其中一個(gè)相的物質(zhì)或溶解在其中的溶質(zhì),在另一相表面上密集的現(xiàn)象,稱(chēng)為吸附。其中,能夠?qū)⑵渌镔|(zhì)聚集到自己表面上的物質(zhì),稱(chēng)吸附劑;聚集于吸附劑表面的物質(zhì)稱(chēng)吸附物。當(dāng)混合物隨流動(dòng)相流經(jīng)由吸附劑組成的固定相時(shí),由于吸附劑對(duì)不同的物質(zhì)具有不同的吸附力,從而使不同組分的移動(dòng)速度也不相同,最終達(dá)到分離的目的。由于吸附過(guò)程可逆的,因此被吸附物在一定條件下可以解析出來(lái)。假如混合物中含A、B兩種物質(zhì),在洗脫過(guò)程中,隨著流動(dòng)相流經(jīng)固定相,它們會(huì)連續(xù)不斷地分別產(chǎn)生解吸-吸附-解吸-吸附的現(xiàn)象。由于洗脫液和吸附劑對(duì)A、B的解吸(溶解)與吸附力不同,A和B的移動(dòng)速度也就不同。溶解度大而吸附力小的物質(zhì)走在前面;溶解度小而吸附力大的物質(zhì)走在后面。經(jīng)過(guò)一段時(shí)間以后,A、B兩種物質(zhì)就會(huì)分開(kāi)。 二、常用吸附劑的類(lèi)型及特性層析用的吸附劑應(yīng)該滿足以下要求:在層析溶劑中不溶解;對(duì)洗脫液及被分離物質(zhì)呈化學(xué)惰性;吸附能力強(qiáng),同時(shí)具吸附可逆性;分子擴(kuò)散速度應(yīng)盡可能地快。常用吸附劑是多孔結(jié)構(gòu)的。粒子大小、形狀以及孔的結(jié)構(gòu)是影響層析的基本因素。下面簡(jiǎn)要介紹幾種常用吸附劑:1.硅膠 硅膠略帶酸性,適用于中性和酸性物質(zhì)的分離,如氨基酸、糖、脂類(lèi)等,其優(yōu)點(diǎn)是:化學(xué)隋性強(qiáng)、吸附量大、制備容易。2.氧化鋁 氧化鋁略帶堿性,適用于中性及堿性物質(zhì)的分離,如生物堿、類(lèi)固醇、維生素、氨基酸等。其優(yōu)點(diǎn)是:吸附量大、價(jià)格低廉、分離效果好。3.活性炭 活性炭大多以木屑為原料。根據(jù)其粗細(xì)程度可分為三種:粉末活性炭:顆粒極細(xì),呈粉末狀,吸附量及吸附力大;顆;钚蕴浚侯w粒較大,比表面積及吸附力都比粉末活性炭;錦綸-活性炭:以錦綸為粘合劑,將粉末活性炭制成顆粒,比表面積介于粉末活性炭和顆;钚蕴恐g,吸附能力較兩者弱。分配層析㈠基本原理分配層析是利用混合物中各組分在兩種不同溶劑中的分配系數(shù)不同而使物質(zhì)得到分離的方法。分配系數(shù)是指一種溶質(zhì)在兩種互不相溶的溶劑中的溶解達(dá)到平衡時(shí),該溶質(zhì)在兩種溶劑中所具濃度之比。不同的物質(zhì)因其在各種溶劑中的溶解度不同,因而具有不同的分配系數(shù)。在一定溫度下,分配系數(shù)可用下式表示:Kd = C2/C1式中,Kd為分配系數(shù);C2是物質(zhì)在固定相中的濃度;C1是物質(zhì)在流動(dòng)相中的濃度。分配系數(shù)與溫度、溶質(zhì)及溶劑的性質(zhì)有關(guān)。 公眾號(hào):畢合生物 畢合生物(www.bihebio.com)提供服務(wù)內(nèi)容:分子生物學(xué)、免疫, 重組蛋白及ELISA相關(guān)、活性小分子化合物、高端化學(xué)、材料化學(xué)、細(xì)胞資源庫(kù)與培養(yǎng)相關(guān)、生命科學(xué)、天然產(chǎn)物 |
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