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科研戰(zhàn)神·王鐵蟲 (小有名氣)
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核糖核酸酶保護(hù)實(shí)驗(yàn)
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核糖核酸酶保護(hù)實(shí)驗(yàn) 核糖核酸酶保護(hù)實(shí)驗(yàn)（Ribonuclease protection assay，RPA）基本原理是將標(biāo)記的特異RNA探針(32P或生物素)與待測(cè)的RNA樣品液相雜交，標(biāo)記的特異RNA探針按堿基互補(bǔ)的原則與目的基因特異性結(jié)合，形成雙鏈RNA；未結(jié)合的單鏈RNA經(jīng)RNA酶A或RNA酶T1消化形成寡核糖核酸，而待測(cè)目的基因與特異RNA探針結(jié)合后形成雙鏈RNA，免受RNA酶的消化。 對(duì)于32P標(biāo)記的探針，雜交雙鏈進(jìn)行變性聚丙酰胺凝膠電泳，用放射自顯影或磷屏成像系統(tǒng)檢測(cè)被保護(hù)的探針的信號(hào); 對(duì)于生物素標(biāo)記的探針，雜交雙鏈經(jīng)過變性聚丙酰胺凝膠電泳后電轉(zhuǎn)移至尼龍膜，采用鏈霉親和素－辣根過氧化物酶（Streptavidin-HRP）和化學(xué)發(fā)光底物與膜上biotin標(biāo)記的探針結(jié)合，X射線膠片或化學(xué)發(fā)光圖像分析儀檢測(cè)雜交信號(hào)。 與Northern雜交相比，核糖核酸酶保護(hù)實(shí)驗(yàn)靈敏度更高；由于沒有PCR擴(kuò)增的步驟、避免了PCR擴(kuò)增造成的偏移，可以更準(zhǔn)確的反應(yīng)RNA的豐度；在一個(gè)反應(yīng)體系中可以同時(shí)檢測(cè)多個(gè)指標(biāo)。 完整的RPA實(shí)驗(yàn)包括探針的制備/標(biāo)記、雜交、RNaseA 消化、變性聚丙酰胺凝膠電泳和信號(hào)檢測(cè)等步驟。具體操作如下： 一、探針的制備/標(biāo)記 探針的制備一般使用體外轉(zhuǎn)錄的方法進(jìn)行。 1.載體構(gòu)建及PCR 構(gòu)建含有探針序列的質(zhì)粒。 設(shè)計(jì)含有T7或SP6啟動(dòng)子的PCR引物，注意：PCR產(chǎn)物是探針的模板，所以啟動(dòng)子序列在下游引物中。 2.體外轉(zhuǎn)錄 利用體外轉(zhuǎn)錄體系，以PCR產(chǎn)物為模板，合成探針。常用的體外轉(zhuǎn)錄體系如下： 4 ul 5倍轉(zhuǎn)錄緩沖液 2 ul 0.1 M DTT 4 ul 2.5 mM NTP（A，C，G） 0.8 ul RNA酶抑制劑（25 U/ μl）（Promega） 100 μM 標(biāo)記UTP（32P） 1 ul RNA聚合酶SP6，T7或T3 總體積 20 ul。 孵育1小時(shí)，37℃。 二、雜交 1.探針純化 可以使用QIAGEN公司的QIAquick核苷酸去除試劑盒或Boehringer離心柱（G50葡聚糖凝膠）進(jìn)行。 2.雜交 RNA提取后溶于雜交緩沖液，調(diào)整濃度為1μg/μL，8μL RNA中加入2μL探針，95℃變性5分鐘，40-55℃孵育4小時(shí)（孵育溫度根據(jù)探針的溶解溫度確定）。 3.消化 1)加入RNAse消化液，37℃保溫30分鐘。 2)加入10%的SDS10μL，蛋白酶K（10μg/μL）20μL，37℃保溫10分鐘。 3)苯酚-氯仿抽提，取上清。 4)異丙醇或無水乙醇沉淀RNA。 5)洗滌、溶解沉淀。 三、聚丙酰胺凝膠電泳 電泳方法同常規(guī)的SDS-PAGE電泳。 四、檢測(cè) 放射自顯影檢測(cè)。 注：探針也可采用非放射性標(biāo)記（如：生物素標(biāo)記），那么隨后的檢測(cè)也需要按照非放射性標(biāo)記的流程進(jìn)行。 在一個(gè)反應(yīng)體系中使用了6種探針，3種不同的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，每一種方法重復(fù)3次（Tam Thuan Nguyen , Jeffrey B Smith.2002） |
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