 |
 |
 |
 |
 |
 |
||
 |
 |
 |
 |
 |
| 1 | 1/1 | 返回列表 |
| 查看: 1380 | 回復(fù): 0 | |||
18317190548新蟲 (小有名氣)
|
[交流]
蛋白/抗體熒光標(biāo)記使用指南及原理解答 - MedChemExpress
|
|
熒光標(biāo)記指將熒光物質(zhì)共價(jià)結(jié)合或物理吸附在所要研究分子的某個(gè)基團(tuán)上，具有無(wú)放射物污染、操作簡(jiǎn)便、容易觀察等優(yōu)點(diǎn)，可借助熒光特性對(duì)被標(biāo)記對(duì)象進(jìn)行定性、定位以及定量分析。熒光標(biāo)記在蛋白質(zhì)、核酸、細(xì)胞檢測(cè)及免疫分析等方面顯現(xiàn)出巨大潛能。 表 1. 常見(jiàn)的用于蛋白偶聯(lián)反應(yīng)基團(tuán)。 反應(yīng)很多，本篇只講 NH2 和 SH 反應(yīng) ，在文章末尾小 M 會(huì)告訴大家基本的原理！在這里我們先來(lái)到大家最關(guān)注的環(huán)節(jié)：如何標(biāo)記蛋白？以及使用過(guò)程中有哪些注意事項(xiàng)？ 染料標(biāo)記蛋白，主要包含以下步驟： 蛋白標(biāo)記時(shí)蛋白溶液的配制，以下幾點(diǎn)十分重要！ 關(guān)于溶解：溶解蛋白時(shí)，要根據(jù)推薦的溶劑進(jìn)行溶解，避免使用含伯胺 (例如 Tris，Glycine) 或銨離子的緩沖液，它們與待標(biāo)記蛋白會(huì)發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)降低標(biāo)記效率。低濃度的疊氮化鈉 (≤3 mM 或 0.02％) 或 Thimerosal (≤0.02 mM 或 0.01％) 不會(huì)顯著干擾蛋白標(biāo)記，但是 20-50％ 的甘油會(huì)降低標(biāo)記效率。 標(biāo)記蛋白濃度：蛋白濃度過(guò)低會(huì)大大影響標(biāo)記效率，一般濃度不小于 0.5 mg/mL。若蛋白濃度過(guò)低，可用超濾管濃縮蛋白。 注意事項(xiàng)：蛋白必須在不含伯胺和銨離子的緩沖液中，這些基團(tuán)會(huì)和蛋白爭(zhēng)奪結(jié)合位點(diǎn)，會(huì)影響標(biāo)記效率。 蛋白溶液配好了，我們現(xiàn)在開始配染料溶液，使用無(wú)水 DMSO 配制染料溶液 (多為 10 mM )，染料在 DMSO 穩(wěn)定性較好，剩余染料溶液可在 - 20℃ 分裝保存 1 個(gè)月。如果是水溶解，染料有易被水解的性質(zhì)，建議現(xiàn)配現(xiàn)用。 我們?cè)跇?biāo)記時(shí)，首要注意的是染料和蛋白的配比問(wèn)題，染料過(guò)少，反應(yīng)不完全，標(biāo)記量太少，染料過(guò)多，則不易純化。通常，我們推薦染料與蛋白的摩爾比在 5:1-20:1。 案例： 此處我們以 CY3 為例，假如所需標(biāo)記蛋白為 500 μL 2 mg/mL 的 IgG (MW=150,000)，用 100 μL DMSO 溶解一管 1 mg CY3 染料，則所需 CY3 體積為 3.95 μL，詳細(xì)計(jì)算流程如下： 1)mmol(IgG)=mg/mL(IgG)×mL(IgG)/MW(IgG): 2 mg/mL×0.5 mL/ 150,000 mg/mmol= 6.7×10-6 mmol 2)mmol(CY3)=mmol(IgG)×10: 6.7×10-6 mmol×10=6.7×10-5 mmol 3)μL(CY3)=mmol(CY3)×MW(CY3)/mg/μL(CY3): 6.7×10-5 mmol× 590.15 mg/mmol/0.01 mg/μL =3.95 μL 了解配比后，我們開始孵育，一般將染料和蛋白一起室溫孵育 2 h 即可完成結(jié)合！ 熒光標(biāo)記結(jié)束后，我們需要純化蛋白去掉多余未結(jié)合染料防止其對(duì)實(shí)驗(yàn)的干擾，常用的純化工具為親和層析柱和透析袋。 表 2. 層析柱和透析袋的對(duì)比。 忙忙碌碌終于大功告成，那么如何檢測(cè)我們是否標(biāo)記成功呢，通常是以下幾種： 直接肉眼觀察，根據(jù)上面的純化原理可以得知，如果得到的產(chǎn)物有顏色。我們默認(rèn)標(biāo)記成功； 熒光顯微鏡觀察，通過(guò)熒光顯微鏡在對(duì)應(yīng)通道進(jìn)行拍攝，如果觀察到特定形態(tài)熒光信號(hào)即為標(biāo)記蛋白； 蛋白電泳實(shí)驗(yàn)，標(biāo)記后蛋白本身分子量會(huì)增大，蛋白存在微小向上拖帶可以證明標(biāo)記成功（如果向下大范圍拖帶可能是蛋白發(fā)生降解）。 使用分光光度計(jì)測(cè)定 F（熒光素）和 P（抗體蛋白）的比值（F/P），F(xiàn)/P 的比值反映熒光蛋白的特異性染色質(zhì)量，一般要求 F/P 的克分子比值為1～3。過(guò)高時(shí)，非特異性染色增強(qiáng)；過(guò)低時(shí)，熒光很弱，標(biāo)記效率低。 MCE 標(biāo)記染料 Vari Fluor 系列，很好的滿足您的各種標(biāo)記需要！！ 下面是原理解答時(shí)間！ · 關(guān)于蛋白氨基反應(yīng) 伯胺 (-NH2) 存在于每條多肽鏈的 N-末端 (稱為 α-氨基) 以及賴氨酸殘基的側(cè)鏈中(稱為 ε-氨基)。由于伯胺在生理?xiàng)l件下帶正電荷，因此它通常朝外，使得其更易于偶聯(lián)而不會(huì)使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)改變。從我們的表中可以看出，許多反應(yīng)基團(tuán)均可以和伯胺基結(jié)合，而在熒光標(biāo)記中，最常用的是還是 NHS 活化酯 (SE)[1]。 圖 1. NHS 酯圖示。 NHS 活化酯 (SE) NHS，全稱為 N -羥基琥珀酰亞胺酯，是 EDC (碳二亞胺) 活化羧酸分子形成的反應(yīng)基團(tuán)。帶有活化的 NHS 酯的交聯(lián)劑 和標(biāo)記化合物在弱堿性條件下與伯胺反應(yīng)， 產(chǎn)生穩(wěn)定的酰胺鍵 (圖 3)。該反應(yīng)釋放 N-羥 基琥珀酰亞胺 (NHS)，可通過(guò)透析或脫鹽輕易去除[2]。 圖 2. NHS 反應(yīng)圖示。 · 關(guān)于蛋白巰基反應(yīng) 巰基 (-SH) 存在于半胱氨酸的側(cè)鏈中。在進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)時(shí)，必須將其還原成巰基，使其可以與大多數(shù)類型的反應(yīng)基團(tuán)進(jìn)行交聯(lián)。巰基對(duì)馬來(lái)酰亞胺、鹵代乙�；瓦拎ざ䦷�基具有反應(yīng)活性，在蛋白巰基標(biāo)記中，馬來(lái)酰亞胺的熒光探針最為常見(jiàn)[3]。 圖 3. 馬來(lái)酰亞胺圖示。 馬來(lái)酰亞胺（Maleimides） 馬來(lái)酰亞胺是一種非常常用的反應(yīng)活化基團(tuán)，當(dāng)反應(yīng)混合物的 pH 值在 6.5-7.5 之間時(shí)，馬來(lái)酰亞氨基團(tuán)會(huì)與巰基基團(tuán)特異性反應(yīng)，形成不可逆的穩(wěn)定硫醚鍵。在堿性更強(qiáng)的條件下（pH>8.5），支持伯胺偶聯(lián)，并且還會(huì)增加馬來(lái)酰亞氨基團(tuán)水解成非反應(yīng)性馬來(lái)酰胺酸的速率。馬來(lái)酰亞胺不與酪氨酸、組氨酸或蛋氨酸反應(yīng)。需要注意的是，馬來(lái)酰亞胺酯是一種非活化染料，使用帶有馬來(lái)酰亞胺酯的熒光探針時(shí)，需用 DTT 活化后方可進(jìn)行后續(xù)標(biāo)記[4]。 圖 4. 馬來(lái)酰亞胺化學(xué)偶聯(lián)到巰基的反應(yīng)圖式。 參考文獻(xiàn)： [1] Mattson G, et al. A practical approach to crosslinking. Mol Biol Rep. 1993 Apr;17(3):167-83. [2] Grabarek Z, et al. Zero-length crosslinking procedure with the use of active esters. Anal Biochem. 1990 Feb 15;185(1):131-5. [3] Staros JV, et al. Enhancement by N-hydroxysulfosuccinimide of water-soluble carbodiimide-mediated coupling reactions. Anal Biochem. 1986 Jul;156(1):220-2. [4] Timkovich R. Detection of the stable addition of carbodiimide to proteins. Anal Biochem. 1977 May 1;79(1-2):135-43. |
回復(fù)此樓» 猜你喜歡
招調(diào)劑
已經(jīng)有7人回復(fù)
-
0703 東華大學(xué) 理學(xué)化學(xué)均過(guò) a 線，總分 281 求調(diào)劑
已經(jīng)有8人回復(fù)
-
材料學(xué)碩318求調(diào)劑
已經(jīng)有21人回復(fù)
-
271求調(diào)劑
已經(jīng)有5人回復(fù)
-
328求調(diào)劑
已經(jīng)有5人回復(fù)
-
080500材料科學(xué)與工程
已經(jīng)有11人回復(fù)
-
成果系統(tǒng)訪問(wèn)量大，請(qǐng)15分鐘后再嘗試。由此給您造成的不便，敬請(qǐng)諒解。
已經(jīng)有17人回復(fù)
-
282求調(diào)劑
已經(jīng)有4人回復(fù)
-
304求調(diào)劑
已經(jīng)有4人回復(fù)
-
化工282求調(diào)劑一志愿211
已經(jīng)有4人回復(fù)
» 本主題相關(guān)商家推薦: (我也要在這里推廣)
相關(guān)版塊跳轉(zhuǎn)
我要訂閱樓主 18317190548 的主題更新
| 1 | 1/1 | 返回列表 |
| 最具人氣熱帖推薦 [查看全部] | 作者 | 回/看 | 最后發(fā)表 | |
|---|---|---|---|---|
|
[考研] A區(qū)一本交叉課題組，低分調(diào)劑，招收機(jī)械電子信息通信等交叉方向 +12 | lisimayy 2026-03-04 | 20/1000 |
|
|---|---|---|---|---|
|
|
[考研] 085600材料與化工，一志愿廣州985，求調(diào)劑 +4 | qqyyaill 2026-03-05 | 4/200 |
|
|
[考研] 334求調(diào)劑 +3 | Trying] 2026-03-03 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 求調(diào)劑 +3 | 泡了個(gè)椒 2026-03-04 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 江西師范大學(xué)王昆-盧章輝課題組招化學(xué)方向碩士研究生兩名 +3 | 哈哈大俠 2026-02-28 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 301求調(diào)劑 +4 | 李LJR 2026-03-04 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 考研282分求調(diào)劑，接受跨專業(yè) +4 | 劉淄博 2026-03-04 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 302材料工程求調(diào)劑 +7 | Doleres 2026-03-01 | 8/400 |
|
|
|
[考研]
 一志愿中南大學(xué)理學(xué)化學(xué)
+6
|
15779376950 2026-03-01 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 化工專碩348，一志愿985求調(diào)劑 +8 | 弗格個(gè) 2026-02-28 | 11/550 |
|
|
|
[考研] 26考研報(bào)考西工大材料308分求調(diào)劑 +4 | weizhong123 2026-03-01 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 271求調(diào)劑 +4 | Ricardo1113 2026-03-02 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 338求調(diào)劑 +5 | 18162027187 2026-03-02 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 0856調(diào)劑 +10 | 劉夢(mèng)微 2026-02-28 | 10/500 |
|
|
|
[考研] 0856求調(diào)劑285 +11 | 呂仔龍 2026-02-28 | 11/550 |
|
|
|
[考研] 085600材料工程一志愿中科大總分312求調(diào)劑 +9 | 吃宵夜1 2026-02-28 | 11/550 |
|
|
|
[考研] 274求調(diào)劑 +3 | cgyzqwn 2026-03-01 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 275求調(diào)劑 +3 | L-xin? 2026-03-01 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 化工299分求調(diào)劑 一志愿985落榜 +5 | 嘻嘻(*^ω^*) 2026-03-01 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 311求調(diào)劑 +6 | 亭亭亭01 2026-03-01 | 6/300 |
|