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提取總RNA，最少需要多少培養(yǎng)的細(xì)胞
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用Trizol來提取細(xì)胞總RNA的話，一個(gè)6孔板的細(xì)胞足夠了。對(duì)于貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞，可將培養(yǎng)基吸出后直接向培養(yǎng)板中加入Trizol來溶解細(xì)胞，然后分次移出細(xì)胞裂解物進(jìn)行后續(xù)操作即可。值得注意的是，對(duì)于所加Trizol的量，是依據(jù)培養(yǎng)板的面積而不是依據(jù)細(xì)胞的數(shù)量來決定用量的（一般每10cm2加1ml）。當(dāng)Trizol量不足時(shí)可導(dǎo)致抽提的RNA中污染有DNA。另外，在Trizol的使用說明中的注意事項(xiàng)提及，如果細(xì)胞量太少（100~10000個(gè)細(xì)胞），可加入800ul的Trizol，后續(xù)裂解、加氯仿按常規(guī)操作。在用異丙醇沉淀RNA前加入5-10ug無RNA酶的糖原作為水相的載體。其會(huì)保留在水相，與RNA共沉淀，且不影響后續(xù)的逆轉(zhuǎn)錄及PCR反應(yīng)。 加入1ml TRIzol裂解細(xì)胞（用手劇烈搖晃），裝入1.5ml Eppendorf管中，冰上放置10min。 加入200μl氯仿，震搖15s，冰上放置5min。 13500rpm，4℃離心15min。 收集上清水相一般為500uL，加入等體積異丙醇，上下顛倒混勻，冰上放置10min。 13500rpm，4℃離心10min,棄上清。 加入1ml的75%乙醇，上下顛倒混勻后冰上放置5min，12000rpm，4℃離心5min。 棄上清，待殘余乙醇揮發(fā)殆盡后，沉淀重懸于20μl用DEPC處理水中，存于-70℃。 用分光光度計(jì)測(cè)OD260/280nm波長的吸光值鑒定RNA濃度，以瓊脂糖凝膠電泳證實(shí)其完整性。10-5細(xì)胞數(shù)，提取的濃度一般檢測(cè)為500-1000ug/mL 公眾號(hào)：畢合生物 畢合生物（www.bihebio.com)提供服務(wù)內(nèi)容：分子生物學(xué)、免疫, 重組蛋白及ELISA相關(guān)、活性小分子化合物、高端化學(xué)、材料化學(xué)、細(xì)胞資源庫與培養(yǎng)相關(guān)、生命科學(xué)、天然產(chǎn)物 |
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