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科研戰(zhàn)神·王鐵蟲(chóng) (小有名氣)
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基因表達(dá)調(diào)控，如何選擇？上調(diào)？敲降？
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干貨分享 | 基因表達(dá)調(diào)控，如何選擇？上調(diào)？敲降？ 在基因功能研究中常用兩種基礎(chǔ)策略，功能減弱或缺失，功能增強(qiáng)或獲得。 實(shí)現(xiàn)基因功能減弱，可以采用RNA干擾（RNAi）技術(shù)下調(diào)目的基因表達(dá)。在RNAi使用中，siRNA或shRNA的設(shè)計(jì)是關(guān)鍵。長(zhǎng)度約為21bp的siRNA與蛋白形成RISC復(fù)合物，結(jié)合目的基因的mRNA，從而使其降解，達(dá)到降低基因表達(dá)水平的目的（注意RNAi是作用于mRNA水平）。但需要引起注意的是，如果目的基因在細(xì)胞中本體表達(dá)就較低的情況下（一般ΔCT＞16），就不適合用RNAi了。 隨著CRISPR/Cas9技術(shù)的成熟，越來(lái)越多的科研人員采用基因敲除的方式實(shí)現(xiàn)基因徹底缺失的目的。與RNAi不同的是，基因敲除理論上可作用于基因組上所有的基因片段，并使目的基因的蛋白完全不表達(dá)，從而更有利于觀察細(xì)胞表型的變化，簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，就是更容易做出實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 CRISPR/Cas9基因敲除和RNAi干擾表達(dá)，哪種調(diào)控方式更好？ 1、沒(méi)有更好，只有最適合！ 1、兩種方法沒(méi)有絕對(duì)的好壞，通常RNAi技術(shù)由于操作簡(jiǎn)便，使用廣泛，但CRISPR/Cas9可使基因功能喪失更徹底，因此近些年受到廣泛追捧。 2、某些情況下不適合用RNAi，例如需要改變無(wú)法轉(zhuǎn)錄的DNA區(qū)域，只能用基因敲除。 3、某些特殊情況，敲除該基因會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，停滯甚至死亡，這樣獲得基因敲除細(xì)胞株比較困難，因此就需要選擇通過(guò)RNA干擾的手段實(shí)現(xiàn)功能減弱。 2、過(guò)表達(dá)和基因敲入，如何選擇？ 上調(diào)表達(dá)使得功能增強(qiáng)通常采用的方法是將目的基因的編碼區(qū)（CDS）構(gòu)建到載體中，導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)使目的基因的表達(dá)量顯著增加。但基因在細(xì)胞內(nèi)本體表達(dá)已經(jīng)很高時(shí)，此時(shí)再進(jìn)行過(guò)表達(dá)的調(diào)控，細(xì)胞的表型很可能不會(huì)發(fā)生變化，此外，外源高表達(dá)對(duì)細(xì)胞也是個(gè)刺激壓力，會(huì)產(chǎn)生假陽(yáng)性和假陰性的結(jié)果。 而對(duì)于功能獲得，則常采用基因敲入的方法，例如引入標(biāo)記基因序列，便于目的基因的示蹤和定位，或引入調(diào)控表達(dá)元件如增強(qiáng)子，調(diào)控目的基因的表達(dá)；但由于受到同源重組效率和插入基因片段大小的影響，目前細(xì)胞基因敲入存在較高的技術(shù)難度，普通實(shí)驗(yàn)室難以開(kāi)展。 |
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