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高通量篩選 "打開" 神經(jīng)退行性疾病的藥物開發(fā)之路 - MCE
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由于全球的老齡化趨勢加劇，神經(jīng)退行性疾病 (ndds) 的患病風險逐漸升高，對 ndds 病理靶標的發(fā)現(xiàn)及確認更是挑戰(zhàn)滿滿。高通量篩選技術在神經(jīng)退行性疾病中的大量應用無疑加快了相關藥物的開發(fā)速度。今天我們就一起來了解一下吧~ 神經(jīng)退行性疾病 (neurodegenerative diseases, ndds) 是由中樞神經(jīng)系統(tǒng)或周圍神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元功能喪失，導致其功能障礙的一類神經(jīng)系統(tǒng)疾病，通過影響記憶、認知、行為、感覺和運動功能，嚴重影響數(shù)百萬患者的日常生活。 高通量篩選利用自動化系統(tǒng)能夠同時測試數(shù)千至數(shù)百萬個樣品，可在模型生物、細胞、或分子水平上驗證生物活性，篩選已知結構的小分子化合物、化學混合物、天然產(chǎn)物、寡核苷酸和抗體等等。 本期由小 m 帶著大家一起從 ndds 的病理標志出發(fā)，學習一下高通量篩選在神經(jīng)退行性疾病研究中的一些實例吧！ 據(jù) wilson dm 3rd 在 cell 上發(fā)表的綜述“hallmarks of neurodegenerative diseases ”報道，ndds 的標志主要分為八大類：病理性蛋白的聚集、突觸和神經(jīng)元網(wǎng)絡功能障礙、蛋白質穩(wěn)態(tài)失衡、神經(jīng)元細胞骨架異常、能量穩(wěn)態(tài)失衡、脫氧核糖核酸和核糖核酸缺陷、炎癥、神經(jīng)元細胞死亡[1]。而這些標志也是開發(fā) ndds 相關藥物的重要著手點。本期小 m 為大家主要介紹 ndds 的其中三大病理標志。 圖 1. 神經(jīng)退行性疾病的分子學標志[1]。 首先咱們來說說作為 ndds 關鍵病理標志之一的病理性蛋白的聚集。病理性蛋白的過度聚集具有神經(jīng)毒性，會影響神經(jīng)系統(tǒng)的正常功能。例如，在帕金森疾病中，大腦內(nèi) alpha-synuclein (α-syn) 異常沉積形成路易小體；阿爾茲海默癥中，β-淀粉樣蛋白 (aβ) 沉積導致的淀粉樣斑塊，tau 微管結合蛋白磷酸化后形成神經(jīng)元纖維纏結等。 接下來，我們就以 tau 蛋白抑制劑的高通量篩選試驗為例更直觀地感受一下吧~ ▐ 應用：tau 蛋白抑制劑的篩選 相較于傳統(tǒng)的藥物篩選，dehdashti sj 等人運用均相時間分辨熒光技術 (homogeneous time-resolved fluorescence, htrf) 和 alphalisa 實驗進行了快速、高效的高通量篩選，最終從 1280 個化合物中篩選出了 4 個能夠抑制 sh-sy5y 細胞中 tau 蛋白水平的先導化合物，加快了 ndds 中 tau 蛋白抑制劑的篩選速度[2]。 圖 2. alphalisa 和 htrf 法檢測 tau 蛋白含量[2]。(a) tau 蛋白測定的分步程序。將 sh-sy5y 細胞接種在測定板中并孵育 4 小時，然后添加化合物。與化合物一起孵育 3 天后，裂解細胞并添加檢測試劑 (alphalisa 或 htrf)。孵育 2 小時后，使用讀板器捕獲信號。(b) alphalisa tau 測定原理圖示。(c) htrf 測定原理圖示。 多種神經(jīng)退行性疾病中有毒蛋白聚集體的積累與自噬-溶酶體途徑（autophagy-lysosome pathway, alp，真核細胞中維持蛋白質穩(wěn)態(tài)的途徑之一）的缺陷有關，通過調節(jié)溶酶體功能的主調節(jié)因子 tfeb 可以改善多種神經(jīng)退行性疾病模型的疾病表型。 ▐ 應用：tfeb /tfe3 的激酶調節(jié)因子篩選 今年 2 月，carling pj 等人使用高通量篩選從激酶抑制劑庫中發(fā)現(xiàn)了具有神經(jīng)保護作用的 tfeb 和 tfe3 的激酶調節(jié)因子。經(jīng)過進一步的機制研究，作者發(fā)現(xiàn)喹唑啉結構類似物通過上調 clear 基因的轉錄，清除 huntingtin (htt) 聚集體，從而調節(jié)溶酶體功能發(fā)揮抗神經(jīng)損傷作用[3]。 圖 3. 高通量篩選 tfeb 和 tfe3 的激酶調節(jié)因子[3]。 (a) 在所有測定中以 1 μm 篩選 490 種 pkis2 化合物，并通過級聯(lián)分析來鑒定無毒化合物。(b) ak 釋放和 (c) 免疫細胞化學圖像的核計數(shù)用于評估細胞毒性。(d) 活性溶酶體計數(shù)和 (e) 通過 dq red bsa 測定測量的校正熒光強度用于評估溶酶體毒性。對于 (f) 核 tfeb (% ntfeb) 和/或 (g) 核 tfe3 (% ntfe3) 易位�？偣泊_定了 74 個陽性命中。 初篩時，作者使用 ak 含量測定發(fā)光試劑盒檢測了化合物 (1 μm) 對人誘導多能干細胞 (hipsc) 中腺苷酸激酶 (adenylate kinase, ak) 含量變化 (圖 3 b,c)，通過 dq™ red bsa 試劑檢測溶酶體活性情況 (圖 3 d,e)。根據(jù) ak 含量和溶酶體活性結果，作者剔除了能夠誘導細胞毒性或線粒體毒性的化合物。 復篩時，作者使用免疫細胞化學法 (icc) 測定了不同化合物 (0.01-2 μm) 對 tfeb 和 tfe3 入核情況的影響 (圖 3 f,g)，篩選出了 74 種能夠顯著促進 tfeb 或 tfe3 入核的化合物[3]。 神經(jīng)元是一類對能量要求比較高的活躍細胞，能量代謝的紊亂會極大程度的影響神經(jīng)元的正常功能，導致 ndds 疾病的發(fā)生。煙酰胺腺嘌呤二核苷酸 (nad) 是能量代謝過程中的一種重要輔酶，在維持神經(jīng)元健康中發(fā)揮重要作用。 ▐ 靶向 nampt 的小分子激活劑篩選 hong yao 等人根據(jù) nad 代謝調控神經(jīng)退行性疾病這一科學熱點，通過高通量篩選和基于靶點結構的藥物設計，篩選出了靶向nampt (nicotinamide phosphoribosyl transferase, 煙酰胺磷酸核糖基轉移酶，是 nad 合成的一大關鍵限速酶) 的小分子激活劑 (nat)，實驗結果證明 nat 能夠通過促進 nad 的生物合成，發(fā)揮神經(jīng)保護作用[4]。 圖 4. 高通量篩選鑒定一種新的nampt 激活劑[4]。 (a) 高通量篩選 nampt 激動劑的程序示意圖。(b) 三偶聯(lián)的 nampt 酶反應在室溫下用 dmso 或 10 μm 的 nat 進行 20 分鐘，開始時加入或不加入 nam。(c) 在指定濃度的 nat 或 nat-5r 存在下進行 nmnat1 酶測定。 首先，作者通過高通量篩選體外重組酶實驗篩選出了數(shù)個能激活 nampt 的小分子。從中，作者選擇了能強烈刺激 nampt 活性，但在 nmnat (nicotinamide nucleotide adenylyltransferas, 煙酰胺核苷酸腺苷酸轉移酶) 測定實驗中沒有活性的小分子化合物 nat。 接著，為改善 nat 的藥理學性質，作者對 nat 進行了結構修飾和優(yōu)化，共合成 81 種 nat 衍生物。最后，作者在細胞水平及動物水平中驗證 nat 化合物的作用機制，發(fā)現(xiàn) nat-5r 通過有效提高細胞內(nèi) nad 水平，并誘導隨后的代謝和轉錄重編程過程，從而發(fā)揮神經(jīng)保護作用。 這次小 m 從 ndds 的病理特征出發(fā)，列舉了三個高通量篩選技術應用于神經(jīng)退行性疾病相關藥物篩選的實例，生動的講述了高通量篩選技術從理論到實際操作的一個運用，各位小伙伴們學會了嘛~ mce的所有產(chǎn)品僅用作科學研究或藥證申報，我們不為任何個人用途提供產(chǎn)品和服務。 參考文獻： [1] wilson dm 3rd, et al. hallmarks of neurodegenerative diseases. cell. 2023 feb 16;186(4):693-714. [2] dehdashti sj, et al. a high-throughput screening assay for determining cellular levels of total tau protein. curr alzheimer res. 2013 sep;10(7):679-87. [3] carling pj, et al. multiparameter phenotypic screening for endogenous tfeb and tfe3 translocation identifies novel chemical series modulating lysosome function. autophagy. 2023 feb;19(2):692-705. [4]yao h, et al. discovery of small-molecule activators of nicotinamide phosphoribosyltransferase (nampt) and their preclinical neuroprotective activity. cell res. 2022 jun;32(6):570-584. |
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