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Turtle_tech新蟲 (初入文壇)
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數(shù)字PCR技術——一種高精度、超靈敏的核酸絕對定量技術
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聚合酶鏈式反應（pcr），即dna擴增法，是一種用于擴增特定dna片段的分子生物學技術。這種技術最早是在1983年被美國的mullis提出，并于1985年被發(fā)明。pcr技術從發(fā)明至今已有35年歷史，技術發(fā)展相對成熟。 pcr技術發(fā)展至今已至第三代，經(jīng)歷了定性pcr技術、定量pcr技術（qpcr）與數(shù)字pcr技術（dpcr）三個階段。不同階段的pcr技術的特點、應用情況與行業(yè)發(fā)展情況也不盡相同。 數(shù)字pcr（digital pcr，dpcr）是20世紀90年代末發(fā)展起來的一種核酸分子絕對定量技術。dpcr檢測過程主要包括樣品的分散、pcr擴增、熒光信號采集與數(shù)據(jù)分析。試驗結果通過對反應單元總數(shù)和陽性反應單元數(shù)目進行統(tǒng)計，根據(jù)泊松分布公式計算出dna模板分子的起始濃度，從而實現(xiàn)絕對定量。 在介紹數(shù)字pcr之前，首先和大家回顧一下熒光定量pcr技術（real time pcr, qpcr）。熒光定量pcr在操作流程上包括：a.核酸分子提��；b.rna逆轉錄；c.熒光定量pcr檢測這三步驟。在檢測原理上熒光定量pcr主要包括兩種方法：a.染料法（sybrgreen或eva green）；b.taqman探針法。 數(shù)字pcr（digital pcr，dpcr） 數(shù)字pcr技術，是一種熒光定量pcr技術的升級技術。依然是利用染料法或taqman探針法進行的熒光檢測，不同的是dpcr是終點檢測熒光信號，qpcr是實時檢測熒光信號。而數(shù)字pcr之所以是熒光定量的升級技術，主要是利用單分子擴增實現(xiàn)核酸的絕對定量。數(shù)字pcr將單個dna分子置于獨立的反應室中，并對其進行pcr擴增，利用taqman探針法或染料法檢測特定的靶序列。 數(shù)字pcr檢測主要包括三步：第一，通過特定技術將pcr反應混合液分散到幾萬個反應單元（反應室）；第二，單分子在反應室中擴增；第三，pcr結束后檢測熒光信號，最后通過泊松分布統(tǒng)計數(shù)數(shù)，計算出樣本的拷貝數(shù)，實現(xiàn)核酸分子的絕對定量。與qpcr相比dpcr的絕對定量不需要利用標準曲線實現(xiàn)定量，而是直接可以通過單分子擴增結合泊松分布統(tǒng)計，既可實現(xiàn)絕對定量。 因此，數(shù)字pcr與熒光定量pcr不同點，主要體現(xiàn)在數(shù)字pcr需要進行分區(qū)后擴增，而熒光定量pcr是不需要分區(qū)擴增，而這種分區(qū)即可實現(xiàn)核酸分子的單分子擴增，單分子擴增既可以提高擴增效率，同時可以提高熒光檢測的靈敏性和數(shù)據(jù)的可重復性。 dpcr與qpcr比較 實時熒光定量pcr可以進行相對定量，利用一系列已知濃度的標準品制作標準曲線，在相同的條件下目的基因測得的熒光信號量同標準曲線進行比較，從而得到目的基因的量，標準品可選擇純化的質粒dna或體外合成的ssdna等，qpcr的定量是相對標準品的定量，是一種相對定量技術。 數(shù)字pcr 是基于傳統(tǒng)pcr、實時熒光定量pcr基礎上發(fā)展起來的第3代pcr技術，它不需要標準品，也不要制作標準曲線，即能實現(xiàn)更靈敏、更準確的絕對定量。同時，數(shù)字pcr是單分子擴增技術，能夠有效避免反應抑制劑的影響。隨著反應室的增加，反應受到抑制劑的影響就越小。 數(shù)字PCR分區(qū)方法 數(shù)字pcr的主要核心點在于將pcr反應液分區(qū)至數(shù)萬微反應單元，實現(xiàn)單分子擴增。不同廠家利用不同方法實現(xiàn)核酸分子的分區(qū)，目前數(shù)字pcr分區(qū)方法主要包括2種：微滴數(shù)字pcr(droplet digital pcr，ddpcr)和芯片數(shù)字pcr(chip digital pcr，cdpcr)。分別通過微液滴和微流體芯片實現(xiàn)分液，分隔開的每個微小區(qū)域都可進行單獨的pcr反應。 1）ddpcr技術，利用油包水微滴生成技術。2）cdpcr利用微流控芯片技術將樣品的制備、反應、分離和檢測等集成到一塊芯片上。 數(shù)字pcr技術應用 數(shù)字pcr具有明顯的優(yōu)勢，已經(jīng)廣泛應用于核酸檢測的方方面面。腫瘤液態(tài)活檢，遺傳生殖檢測，公共衛(wèi)生檢測，環(huán)境微生物檢測，rna表達檢測，ngs文庫定量，甲基化檢測的等。后期將推出數(shù)字pcr具體的應用，歡迎大家持續(xù)關注。也希望大家了解數(shù)字pcr后，能夠幫助大家更好地解決目前面臨的困難。 |
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- 專業(yè): 臨床檢驗新技術
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數(shù)字PCR如何發(fā)展才能兼?zhèn)涞蛢r、快速、精準、操作簡單和多靶點檢測？ 發(fā)展方向1：檢測速度快 目前市場化的數(shù)字PCR技術完成一輪檢測時間在2-4小時不等，與現(xiàn)有分子檢測技術相比，已滿足檢測速度快的需求，未來數(shù)字PCR結合等溫擴增技術有極大可能實現(xiàn)30min以內(nèi)，完成一輪檢測�？梢愿玫貞门c病原體感染領域。 發(fā)展方向2：操作靈活簡單 數(shù)字PCR已經(jīng)從實驗室時代進入市場化時代，從操作復雜的分體機時代進入全自動一體機時代。縱觀國際和國內(nèi)廠家，包括伯樂、凱杰和賽默飛等國際品牌已實現(xiàn)數(shù)字PCR一體機市場化。國內(nèi)包括思納福、小海龜、新羿、領航已實現(xiàn)數(shù)字PCR一體機市場化，其中思納福和小海龜?shù)囊惑w機還能同時實現(xiàn)自動化樣本上樣功能。滿足分子診斷領域對操作靈活、自動化檢測的需求。 發(fā)展方向3：價格便宜 目前大家普遍認為限制數(shù)字PCR技術發(fā)展的主要原因是數(shù)字PCR使用成本昂貴，單個反應耗材成本從幾百元到幾十元不等，昂貴的耗材成本讓大家望而卻步。據(jù)了解，現(xiàn)階段單個反應在20元-30元是大家普遍可以接受的，未來隨著數(shù)字PCR市場的全面普及，相信使用成本可以達到與熒光PCR基本相同的水平。這也是數(shù)字PCR廠家為之奮斗的目標之一。 發(fā)展方向4：檢測靶點多（超多重） 數(shù)字PCR與熒光PCR一樣，都屬于PCR技術，具有相同的熒光檢測方法（Taqman探針法和熒光染料法），兩者均受限于熒光通道數(shù)的問題，單個反應只能實現(xiàn)個位數(shù)靶點檢測，一般單個反應實現(xiàn)1-6個靶點。為了克服這一行業(yè)痛點問題，數(shù)字PCR領域的行業(yè)專家都在努力探索，并且取得了重要進展。包括前面提到的南京普濟生物在布局特殊的引物設計+體系優(yōu)化的超多重技術；上海小海龜在布局2N指數(shù)級超多重數(shù)字PCR技術。 南京普濟生物的數(shù)字PCR超多重技術，通過特殊的引物設計+體系優(yōu)化，極大抑制了非特異擴增。據(jù)稱目前最多實現(xiàn)300重檢測。據(jù)了解該技術目前已經(jīng)三大領域均有產(chǎn)品布局，包括1)腫瘤伴隨診斷（結直腸癌和肺癌）；2）無創(chuàng)產(chǎn)前診斷；3）腫瘤預后監(jiān)控。 小海龜超多重技術基于獨創(chuàng)的“固態(tài)油隔水”技術，利用創(chuàng)新的超高特異性分子診斷酶及熒光編解碼技術，可實現(xiàn)指數(shù)級超多重檢測，單個反應/芯片理論上可實現(xiàn)幾十至上百重的靶點檢測。目前布局的產(chǎn)品包括：1）病原體超多重檢測；2）腫瘤液態(tài)活檢。 個人認為，數(shù)字PCR如果解決了PCR多重檢測的行業(yè)痛點問題，勢必用PCR的檢測成本實現(xiàn)NGS臨床應用，對二代測序技術的小panel可能會有沖擊。因此，超多重數(shù)字PCR技術的出現(xiàn)，全面兼?zhèn)鋬r格便宜、檢測速度快、準確度高、操作簡單、檢測靶點多等優(yōu)勢，必將成為分子診斷最佳技術選擇。 |
2樓2024-03-15 17:14:56
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