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星月生物新蟲(chóng) (初入文壇)
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[交流]
《Advanced Materials》:蠶絲蛋白對(duì)干細(xì)胞功能調(diào)節(jié)和組織再生修復(fù)的效應(yīng)和機(jī)制 已有1人參與
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中國(guó)作為最早繅絲養(yǎng)蠶的國(guó)家，孕育的蠶絲文化源遠(yuǎn)流長(zhǎng)。隨著科技的進(jìn)步及多學(xué)科的交叉融合，蠶絲的應(yīng)用已不局限于傳統(tǒng)的紡織領(lǐng)域，其在組織工程和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域亦展現(xiàn)出巨大的潛力。絲素蛋白(SF)和絲膠蛋白(SS)是蠶絲的兩種主要蛋白，是一種極具吸引力的生物材料，在組織工程和再生醫(yī)學(xué)中具有很大的應(yīng)用潛力。然而，它們與干細(xì)胞的生化相互作用尚不清楚。為探究蠶絲材料內(nèi)在生化信號(hào)，闡明其對(duì)細(xì)胞功能和組織再生的整體影響，東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院張薇/陳佳林團(tuán)隊(duì)首次采用多組學(xué)測(cè)序全面解析了蠶絲蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞響應(yīng)及分子機(jī)制，在深入的高通量分子水平上闡明干細(xì)胞-蠶絲材料之間的相互作用，為蠶絲生物材料在組織工程和干細(xì)胞治療領(lǐng)域的應(yīng)用提供更加全面的見(jiàn)解。 相關(guān)論文以“ Silk fibroin and sericin differentially potentiate the paracrine and regenerative functions of stem cells through multiomics analysis”為題，發(fā)表在國(guó)際權(quán)威學(xué)術(shù)期刊Advanced Materials（IF=32.086）上。 首先，研究團(tuán)隊(duì)評(píng)估了SF和SS對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）的細(xì)胞行為和功能的影響。研究者使用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8（CCK-8）測(cè)定了MSC在暴露于0.01%至1%（w/v）各種濃度的SF和SS時(shí)的增殖情況。在不同濃度SF和SS下分別培養(yǎng)1，3，7天，MSCs增值正常（圖1C、D）。結(jié)果表明0.2%（w/v）SF和SS都顯著促進(jìn)了MSC的增殖，這與之前的報(bào)道一致，即SF和SS可以作為生物活性分子來(lái)支持組織工程應(yīng)用中的細(xì)胞增殖。由于0.2%（w/v）SF或SS處理的MSC增殖水平較高，因此選擇該特定濃度進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)�；�/死細(xì)胞染色結(jié)果顯示無(wú)論有沒(méi)有SF或SS處理，MSC在處理后的第1、3和7天均表現(xiàn)出高細(xì)胞活力，SF和SS對(duì)MSCs的增殖和活力有輕微的促進(jìn)作用（圖1E）。之后使用Alamar Blue測(cè)定方法評(píng)估SF和SS對(duì)MSC代謝（線粒體）活動(dòng)的影響，并且在這三組之間未觀察到顯著差異（圖1F）。F-肌動(dòng)蛋白染色和劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示SF和SS可以促進(jìn)MSC中F-肌動(dòng)蛋白的形成（圖1G），但是SF或SS并未顯著提高M(jìn)SCs遷移能力。最后通過(guò)進(jìn)行ALP、油紅O和阿爾新藍(lán)染色評(píng)估了用/不用SF或SS處理的MSC的成骨、脂肪和軟骨形成分化，但SF和SS對(duì)MSCs的分化潛能無(wú)顯著影響（圖1I-K）。SF和SS在促進(jìn)干細(xì)胞增殖和活力方面的有限生物活性似乎不足以闡明SF和SS在絲基組織工程和再生醫(yī)學(xué)中的引人注目的治療作用，需要進(jìn)一步的探討。 之后，研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)多組學(xué)解析了SF和SS介導(dǎo)的細(xì)胞響應(yīng)，發(fā)現(xiàn)SF和SS分別通過(guò)Integrin/PI3K/Akt和糖酵解信號(hào)通路顯著增強(qiáng)MSCs的旁分泌功能，這些功能涉及細(xì)胞外基質(zhì)沉積、血管生成和免疫調(diào)控等多種組織再生關(guān)鍵過(guò)程。 蛋白組學(xué)分析結(jié)果顯示在SF和對(duì)照組中，我們確定了幾個(gè)與“表皮發(fā)育”、“角化”、“細(xì)胞粘附”、“皮膚發(fā)育”、“角質(zhì)形成細(xì)胞分化”、“表皮發(fā)育的正調(diào)節(jié)”、“周?chē)窠?jīng)系統(tǒng)軸突再生”、“上皮細(xì)胞分化”和“傷口愈合”相關(guān)的關(guān)鍵GO術(shù)語(yǔ)（圖2G）。同樣，在SS和對(duì)照組之間，幾個(gè)BP的GO術(shù)語(yǔ)（包括“表皮發(fā)育”、“細(xì)胞外基質(zhì)組織”、“細(xì)胞粘附”、“膠原纖維組織”、“角化”、“糖酵解過(guò)程”、“調(diào)節(jié)細(xì)胞粘附”、“細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)”、“上皮細(xì)胞分化”和“傷口愈合”）與對(duì)照組相比，顯著豐富（圖2H）。這些結(jié)果強(qiáng)烈表明，MSC響應(yīng)SF和SS提供的旁分泌信號(hào)具有調(diào)節(jié)皮膚修復(fù)和再生的潛力。隨后，KEGG分析顯示，SF組中分泌蛋白組的變化與多種細(xì)胞通路相關(guān)，包括“ECM-受體相互作用”、“PI3K/Akt信號(hào)通路”、“粘著斑”和“補(bǔ)體與凝血級(jí)聯(lián)”（圖2I）。除了這些途徑外，“果糖和甘露糖代謝”、“HIF-1信號(hào)通路”和“糖酵解/糖異生”還從SS與Ctrl中MSC顯著變化的旁分泌產(chǎn)物中得到豐富（圖2J）。這些信號(hào)通路從SF或SS處理后改變的MSCs分泌蛋白組中富集，與我們的RNA-seq數(shù)據(jù)高度一致，證實(shí)了這些旁分泌信號(hào)在細(xì)胞對(duì)SF和SS的反應(yīng)中的關(guān)鍵作用。由于RNA-seq結(jié)果顯示與生長(zhǎng)因子和膠原相關(guān)ECM相關(guān)的基因發(fā)生顯著變化，我們專(zhuān)門(mén)研究了它們相應(yīng)蛋白質(zhì)的分泌（圖2K）。與我們的RNA-seq數(shù)據(jù)一致，觀察到這些蛋白質(zhì)的表達(dá)和分泌發(fā)生顯著變化，并且SF組的膠原蛋白（COL1A1、COL1A2、COL4A1、COL5A2、COL6A1和COL6A3）和生長(zhǎng)因子（胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白(IGFBP)3、IGFBP4和IGFBP7）優(yōu)于Ctrl或SS組（圖2K）。 最后，研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)這些由SF和SS介導(dǎo)的旁分泌信號(hào)對(duì)皮膚傷口愈合的多種生物過(guò)程具有調(diào)控作用。因此，研究團(tuán)隊(duì)分別在體內(nèi)外驗(yàn)證了SF和SS介導(dǎo)的旁分泌信號(hào)可通過(guò)調(diào)節(jié)皮膚微環(huán)境中多種常駐細(xì)胞（包括成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞）的行為和功能，進(jìn)而有效促進(jìn)皮膚再生。 為了探究MSCs旁分泌產(chǎn)物的影響，收集了用/不用SF或SS處理的MSC的CM，并將其應(yīng)用于成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)（圖3A）。為了評(píng)估來(lái)自MSCs的旁分泌信號(hào)對(duì)皮膚修復(fù)的潛力，首先研究了它們對(duì)人類(lèi)真皮成纖維細(xì)胞行為的影響。CCK-8測(cè)定表明SF或SS誘導(dǎo)的MSCs的這些旁分泌信號(hào)在促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖（圖3B）。此外，與第1天的Ctrl CM相比，SS CM略微增加了成纖維細(xì)胞的細(xì)胞活力（圖3C）。隨后使用劃痕試驗(yàn)評(píng)估了不同CM對(duì)成纖維細(xì)胞遷移的影響。代表性圖像和定量分析表明，與 Ctrl CM 和 SF CM 相比，SS CM 顯著促進(jìn)了成纖維細(xì)胞的遷移，而 SF CM 對(duì)成纖維細(xì)胞沒(méi)有明顯的促遷移作用（圖 3D）�？傊�，這些發(fā)現(xiàn)表明，SF 誘導(dǎo)的 MSCs 分泌旁分泌因子可以促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖，而 SS 刺激的信號(hào)增強(qiáng)成纖維細(xì)胞的增殖、活力和遷移。 SF水凝膠和SS水凝膠在大鼠體內(nèi)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明SF和SS通過(guò)誘導(dǎo)MSCs的旁分泌作用，顯著增加創(chuàng)面愈合，促進(jìn)皮膚修復(fù)和再生。作者成功建立了大鼠全層皮膚缺損模型，并應(yīng)用 MSC 種子水凝膠來(lái)評(píng)估 MSC 與 SF 或 SS 相互作用的旁分泌信號(hào)對(duì)體內(nèi)傷口愈合的影響。總的來(lái)看， SF 和 SS 水凝膠之間的傷口愈合率沒(méi)有顯著差異，表明 SF 和 SS 對(duì) MSCs 在加速傷口愈合方面的作用相當(dāng)（圖4A-C）。 染色結(jié)果表明所有三組都顯示出完整的表皮再生以及真皮區(qū)域形成良好且完整的膠原樣組織形成。然而，SF 和 SS 水凝膠中存在明顯的皮膚附屬物，其特征是真皮的完全重塑，但 Ctrl 水凝膠中沒(méi)有（圖 4D-E）。皮膚厚度的定量分析表明，與 Ctrl 水凝膠組（1.46 毫米）相比，SF（1.86 毫米）和 SS（1.88 毫米）水凝膠組的皮膚厚度顯著增加，而 SF 和 SS 水凝膠之間沒(méi)有顯著差異組（圖 4F）。此外，SF 和 SS 增強(qiáng)了新形成的皮膚組織的血管生成，新血管的數(shù)量和橫截面積明顯高于 Ctrl 水凝膠組（圖4G-H），這可能歸因于更高的分泌SF 和 SS 水凝膠組中 MSCs 的血管生成因子。此外，在SF和SS水凝膠中觀察到的毛囊數(shù)量高于Ctrl水凝膠（圖4I）。這些結(jié)果表明，SF 和 SS 水凝膠在結(jié)構(gòu)和功能上都誘導(dǎo)了增強(qiáng)的皮膚修復(fù)和再生。 最后，比較SF和SS水凝膠組之間的差異。為了全面評(píng)估不同處理后的傷口微環(huán)境，對(duì)第14天大鼠再生皮膚組織樣本(每組n = 3只大鼠)進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析(圖5A)。聚類(lèi)分析后的所有鑒定蛋白熱圖顯示，Ctrl、SF和SS水凝膠組之間的蛋白表達(dá)存在差異(圖5B)。采用Ctrl、SF、SS水凝膠組進(jìn)行兩兩比較，鑒定DEPs (p < 0.05)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SF和Ctrl水凝膠組之間有78個(gè)蛋白差異表達(dá)，其中47個(gè)蛋白上調(diào)，31個(gè)蛋白下調(diào)(圖5C)。在SS和Ctrl水凝膠組中，我們檢測(cè)到79個(gè)DEPs，其中38個(gè)上調(diào)，41個(gè)下調(diào)(圖5D)。此外，SF水凝膠組與SS水凝膠組比較，發(fā)現(xiàn)32個(gè)DEPs上調(diào)，15個(gè)DEPs下調(diào)(圖5E)。在這些DEPs中，分別有39和58個(gè)DEPs是SF vs Ctrl和SS vs Ctrl特異性的，只有9個(gè)DEPs是SF vs SS特異性的(圖5F)。圖5G,H揭示了不同處理后創(chuàng)面環(huán)境更重要的變化。為了進(jìn)一步了解傷口微環(huán)境中DEPs的功能，我們進(jìn)行了氧化石墨烯富集分析。在SF和Ctrl組中，幾個(gè)BP GO術(shù)語(yǔ)從DEPs上調(diào)中顯著富集，包括“傷口愈合”、“膠原纖維組織”和“突觸可塑性的積極調(diào)節(jié)”(圖5I)。此外，與Ctrl水凝膠組相比，SF水凝膠組CC和MF的氧化石墨烯術(shù)語(yǔ)有幾個(gè)顯著上調(diào)，如“細(xì)胞外基質(zhì)”、“細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)成分”、“膠原結(jié)合”和“血小板衍生生長(zhǎng)因子結(jié)合”(圖5J)，這可能是由MSCs的旁分泌信號(hào)介導(dǎo)的。此外，為了克服DEPs分析的局限性，進(jìn)行了基因集富集分析(GSEA)，發(fā)現(xiàn)SF水凝膠激活了“傷口愈合調(diào)節(jié)”、“組織重塑”和“軸突引導(dǎo)”，同時(shí)抑制了傷口愈合過(guò)程中的“白細(xì)胞趨化性”，導(dǎo)致SF水凝膠組與Ctrl水凝膠組相比，皮膚再生能力增強(qiáng)(圖5K)。就SS與Ctrl而言，我們發(fā)現(xiàn)BP和MF的重要GO術(shù)語(yǔ)中增強(qiáng)了“糖酵解過(guò)程”、“糖異生”和“磷酸丙酮酸水合酶活性”(圖5L)，表明SS水凝膠組創(chuàng)面糖酵解增強(qiáng)。KEGG分析和GSEA也證實(shí)了這一點(diǎn)(圖5N)。我們還觀察到一些下調(diào)的bp有助于加速傷口愈合，包括“負(fù)調(diào)控成纖維細(xì)胞增殖”、“負(fù)調(diào)控壞死細(xì)胞死亡”和“負(fù)調(diào)控凋亡過(guò)程”(圖5L)。CC的重要GO術(shù)語(yǔ)顯示“細(xì)胞外泌體”和“突觸后密度”上調(diào)(圖5M)，表明傷口愈合過(guò)程中旁分泌和神經(jīng)信號(hào)的傳遞得到改善。此外，觀察到HIF-1信號(hào)也從幾種糖酵解相關(guān)的DEPs (SS vs Ctrl)中富集，包括PGK1, ALDOA, ENO2, ENO3, GAPDH，證實(shí)了SS水凝膠處理皮膚傷口的代謝轉(zhuǎn)換為糖酵解(圖5N)。SS和SF對(duì)比，SF在皮膚修復(fù)方面更加優(yōu)異（圖5P） 在這項(xiàng)研究中，我們應(yīng)用多組學(xué)技術(shù)全面闡明了SF和SS與MSC的生化相互作用，并分析了BP和分子活性的變化。轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組綜合分析一致表明，SF和SS啟動(dòng)了廣泛但不同的細(xì)胞反應(yīng)，并增強(qiáng)了MSC的旁分泌功能，這些功能通過(guò)整合蛋白/PI3K/Akt和糖酵解信號(hào)通路。SF和SS刺激的MSC的這些旁分泌信號(hào)通過(guò)影響皮膚傷口微環(huán)境中多個(gè)常駐細(xì)胞的行為，有效地改善了皮膚修復(fù)和再生。與SS相比，SF在體外和體內(nèi)表現(xiàn)出更好的免疫調(diào)節(jié)作用，表明其作為MSC載體材料的皮膚再生潛力更大。據(jù)我們所知，這是第一項(xiàng)通過(guò)多組學(xué)分析提供細(xì)胞與SF和SS相互作用的全面、可靠見(jiàn)解的研究，這將直接有助于設(shè)計(jì)用于組織工程和干細(xì)胞治療的絲基支架。此外，我們的研究結(jié)果強(qiáng)調(diào)了“組學(xué)”技術(shù)在深入、高通量分子水平上評(píng)估細(xì)胞-生物材料相互作用的重要性和可行性，這可能對(duì)組織工程支架在材料選擇和腳手架設(shè)計(jì)方面的未來(lái)發(fā)展產(chǎn)生廣泛影響。 原文鏈接： https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/adma.202210517 1.png 2.png 3.png 4.png 5.png 6.png |
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2樓2023-12-22 17:09:56
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