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質(zhì)譜技術在抗體藥物分析中的應用
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質(zhì)譜技術是抗體藥物分析最重要的技術手段之一。本文簡述了抗體藥物的發(fā)展和質(zhì)譜技術的原理。對于質(zhì)譜技術在抗體藥物的分析中應用進行了歸類整理，主要分為在一級結構和高級結構分析中的應用。 抗體類藥物是指含有抗體片段的蛋白類藥物，所以在惡性腫瘤、自身免疫性疾病、心血管疾病、感染和器官移植排斥等重大疾病上得到了快速的發(fā)展，是當前生物藥物領域增長最快的一類藥物. 1.抗體藥物發(fā)展新趨勢 在生物藥物領域，抗體藥物占據(jù)著越來越重要的地位，全球銷售排名前10位的藥物中有6個為抗體藥物，抗體藥物按來源分類可以分為：鼠源單克隆抗體、人鼠嵌合抗體、人源化抗體和全人源抗體。目前，批準的單克隆抗體藥物中，人源化單抗和全人源單抗數(shù)量已占據(jù)大多數(shù)。 1.1 抗體藥物偶聯(lián)物（ADC） 抗體藥物偶聯(lián)物（ADC）由單克隆抗體和小分子化合物兩部分組成。通過抗體的靶向作用，ADC 的抗體部分和腫瘤細胞表面抗原特異性識別并結合，通過細胞內(nèi)吞作用，將抗體和小分子化合物一起帶進腫瘤細胞內(nèi)部，釋放出小分子化合物。這樣既可以降低小分子藥物的毒性，同時具有靶向結合的作用。已經(jīng)上市的兩個ADC 是Kadyla 和Adcetris。 1.2 雙特異性抗體（BsAb） 雙特異性抗體（BsAb）是含有兩種特異性抗原結合位點的人工抗體，能在靶細胞和功能分子（細胞）之間架起橋梁，由于基因工程的發(fā)展，目前雙特異性抗體已經(jīng)研發(fā)出多種類型，主要類型有三功能雙特異性抗體、IgG-scFv、三價雙特異性分子、串聯(lián)單鏈抗體（串聯(lián)scFv）、DVD-Ig 等多種形式。 2.質(zhì)譜技術 近年來質(zhì)譜儀性能的顯著改進主要基于開發(fā)出的兩種離子化技術：一種是介質(zhì)輔助的激光解吸/離子化技術。另一種是電噴霧離子化技術。由于這兩種電離技術的出現(xiàn)，使原本只能檢測小分子的質(zhì)譜技術，可以運用于檢測生物大分子。在過去質(zhì)譜技術主要運用于對一級結構和序列的表征，而現(xiàn)在質(zhì)譜技術越來越多地運用于高級結構的分析，而高級結構對于抗體藥物的生物活性至關重要。 3.質(zhì)譜技術在抗體藥物一級結構分析中的應用 3.1 完整抗體藥物精確分子量測定 當?shù)玫娇贵w藥物時，可以直接通過高分辨率的MALDI-TOF或者ESI-MS進行分子量的檢測。通過對于脫糖后分子量的檢測，可以對于抗體藥物進行初步定性分析，并將可以作為藥物常規(guī)放行的分析方法。對于脫糖前的抗體藥物進行分析，可以得到抗體藥物的糖基化類型的信息及糖基化水平的分布，對于快速了解生產(chǎn)工藝與藥物質(zhì)量的關系具有十分重要的意義。 3.2 藥物抗體偶聯(lián)比（DAR） 對于賴氨酸鏈接的抗體偶聯(lián)藥物，采用C4色譜柱及聯(lián)用的質(zhì)譜對去糖基化樣品進行分析，根據(jù)偶聯(lián)不同數(shù)目藥物分子的質(zhì)量數(shù)增加判斷偶聯(lián)數(shù)目。對于質(zhì)譜測定的結果，不僅可以給出確切的藥物抗體偶聯(lián)比值，更能夠給出鏈接不同個小分子藥物的分布情況，及反應過程副產(chǎn)物空鏈接頭的分布情況。 3.3 肽圖譜分析 蛋白被特異酶切后的蛋白酶水解后得到的肽片段質(zhì)量圖譜。由于不同的抗體藥物具有不同的氨基酸序列，蛋白質(zhì)被酶水解后，產(chǎn)生的肽片段也各不相同，肽混合物的質(zhì)量數(shù)具有唯一特征�？梢酝ㄟ^LC-ESI-MS進行肽片段的一級質(zhì)量數(shù)的鑒定，也可以通過LC-ESI-MS/MS對于每個肽片段進行進一步確證，提高肽圖譜的準確性。 3.4 翻譯后修飾研究 蛋白質(zhì)的翻譯后修飾（PTM）對于抗體藥物的生物學功能十分重要。常見的翻譯后修飾有：磷酸化、脫酰胺、甲硫氨酸氧化、糖基化修飾、N端焦谷氨酸環(huán)化，C端賴氨酸切除等。質(zhì)譜分析儀檢測蛋白和肽片段的分子量偏差，可以實現(xiàn)高靈敏、高通量和高精確地鑒別蛋白質(zhì)的翻譯后修飾的種類。 3.5 N端氨基酸序列檢測 常規(guī)N端氨基酸檢測用Edman降解法進行檢測，但是抗體藥物有時候會出現(xiàn)N 端環(huán)化的現(xiàn)象，在這種情況下用Edman降解法需要先對抗體進行去封閉處理，而直接使用質(zhì)譜可以直接測出N端的氨基酸序列，同時可以檢測出N端環(huán)化的相對比 例。 4.質(zhì)譜技術在抗體藥物高級結構分析中的應用 4.1 氫/氘交換質(zhì)譜（HDX-MS） 常規(guī)的質(zhì)譜只能獲得蛋白的一級結構信息。氫/氘交換質(zhì)譜（HDX-MS）可以進行蛋白質(zhì)構象，溶液動力學和表位映射進行分析。在能夠調(diào)查的蛋白質(zhì)的高階結構和動態(tài)結構技術中，HDX-MS已經(jīng)證明適合單克隆抗體和單克隆抗體-抗原復合物的構象分析。 4.2 離子淌度質(zhì)譜法（IM-MS） 離子淌度是根據(jù)蛋白的電荷和形狀選擇性分離的方法，可以區(qū)分相同分子量的蛋白和肽段，可用于檢測蛋白的簡單高級結構。 4.3 高分辨率傅立葉變換離子回旋共振質(zhì)譜（FTICR-MS） 高分辨率傅立葉變換離子回旋共振質(zhì)譜（FTICR-MS）能夠檢測最高質(zhì)量數(shù)的質(zhì)譜儀器，并且有著很高的分辨率。FTICR-MS 是目前被公認為是蛋白質(zhì)組學研究的有力工具，特別是和完整的蛋白質(zhì)鑒定和上/下調(diào)翻譯后修飾（PTM）蛋白質(zhì)的鑒定。 公眾號：畢合生物 畢合生物（www.bihebio.com)提供服務內(nèi)容：分子生物學、免疫, 重組蛋白及ELISA相關、活性小分子化合物、高端化學、材料化學、細胞資源庫與培養(yǎng)相關、生命科學、天然產(chǎn)物 |
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