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科研小努力新蟲(chóng) (小有名氣)
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RNA提取實(shí)驗(yàn)操作步驟、注意事項(xiàng)
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試劑：氯仿，異丙醇，75℅乙醇，無(wú)RNase的水或0.5℅SDS（溶液均需用DEPC處理過(guò)的水配制）。 操作步驟：勻漿處理 a、植物組織 以葉片RNA提取為例.取新鮮葉片在液氮中充分研磨或?qū)⑷~片剪碎后直接在Trizol中研磨,研磨要迅速,最好不要超過(guò)1min.，大約100mg 葉片使用1 ml Trizol。 b、動(dòng)物組織 以鼠肝臟RNA提取為例.取新鮮或-70℃凍存組織,每50-100mg組織加1ml Trizol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理.樣品體積一般不要超過(guò)Trizol體積的10%。 c、單層培養(yǎng)細(xì)胞 直接在培養(yǎng)板中加入Trizol裂解細(xì)胞,每10cm2面積加1ml Trizol.用取樣器吹打幾次. 注意:Trizol加量根據(jù)培養(yǎng)板面積決定,不是由細(xì)胞數(shù)決定.如果Trizol加量不足,可能導(dǎo)致提取的RNA中有DNA污染。 d、細(xì)胞懸液 離心取細(xì)胞，每5-10×106動(dòng)物、植物和酵母細(xì)胞或每107細(xì)菌細(xì)胞加1ml Trizol。加Trizol前不要洗滌細(xì)胞，以免降解mRNA。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞可能需要?jiǎng)驖{儀處理。 e、血液處理 1.直接取新鮮的血液,加入3倍體積紅細(xì)胞裂解液，混勻后室溫放置10min，10 000rpm 離心1min。棄上清，收集白細(xì)胞沉淀。每1ml血液收集的白細(xì)胞沉淀中加入1ml Trizol。 2. 將勻漿樣品在15-30℃放置5mim，使得核酸蛋白復(fù)合物完全分離。 3. 可選步驟:4 ℃ 10 000rpm離心10min，取上清。 如果樣品中含有較多蛋白、脂肪、多糖或肌肉、植物結(jié)節(jié)部分等，可離心去除。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜、多糖、高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織樣品時(shí)，上層是大量油脂，應(yīng)除去。取澄清的勻漿溶液進(jìn)行下一步操作。 4. 每使用1ml Trizol加0.2ml氯仿，蓋好管蓋，劇烈震蕩15s，室溫放置3min。如不能渦旋混勻，可手動(dòng)顛倒混勻2min代替。 5. 4 ℃ 10 000rpm離心10-15min，樣品會(huì)分成三層：紅色的有機(jī)相，中間層和上層無(wú)色的水相，RNA主要在水相中，把水相（約600ul，約為所用Trizol試劑的60%）轉(zhuǎn)移到新管中。（如要分離蛋白質(zhì)和DNA，可保留黃色的有機(jī)相） 6. 在得到的水相溶液中加入等體積的異丙醇，混勻，-20℃ 放置20-30min。 植物或動(dòng)物組織RNA提取中，容易沉淀出大量的蛋白等污染物，導(dǎo)致電泳檢測(cè)時(shí)看不到RNA�？梢园匆韵虏襟E操作減輕污染：在上清中加入1/2體積的異丙醇，1/2體積的RNA助沉劑，然后進(jìn)行以下操作。 7. 4 ℃ 10 000rpm離心10min，去上清。 離心前RNA沉淀經(jīng)常是看不見(jiàn)的，離心后在管側(cè)和管底形成膠狀沉淀。 8. 加入1ml 75%乙醇（DEPC水處理過(guò)的水配制）洗滌沉淀。每使用1ml Trizol至少加1ml乙醇。 9. 4 ℃ 10 000rpm離心2min，棄上清；短暫快速離心，用移液器小心吸棄上清，注意不要吸棄沉淀。 10. 室溫放置晾干（不要晾得過(guò)干，RNA完全干燥后會(huì)很難溶解，大約晾干2-3min左右即可）。加入適量DEPC水（根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，可加30-100ul水）或0.5%SDS，用槍頭吸打幾次，充分溶解RNA。如RNA用于酶切反應(yīng)，勿使用SDS溶液。RNA也可用100℅ 的去離子甲酰胺溶解，-70℃保存。 注意事項(xiàng) 1. 從少量樣品中提取RNA(1-10mg組織或102-104細(xì)胞) ： 加800ul Trizol，樣品裂解后加氯仿，分層，沉淀RNA前，加5-10ug RNase-free糖原，糖原會(huì)與RNA一同沉淀出來(lái)，糖原濃度不高于4mg/ml時(shí)不會(huì)影響反轉(zhuǎn)錄cDNA第一鏈的合成，也不影響PCR反應(yīng)。 2. 勻漿后，加氯仿前，樣品可在-70 ℃放置一個(gè)月以上： RNA沉淀可以保存在75%酒精中，2-8 ℃一個(gè)星期或-20 ℃一年以上。如果要長(zhǎng)期保存，RNA可以溶解于100%去離子甲酰胺中，-70 ℃長(zhǎng)期保存。 預(yù)防RNase污染，應(yīng)注意以下幾個(gè)方面 1. 經(jīng)常更換新手套。因?yàn)槠つw經(jīng)常帶有細(xì)菌，可能導(dǎo)致RNase污染。 2. 使用無(wú)RNase的塑料制品和槍頭，避免交叉污染。 3. RNA在Trizol試劑中不會(huì)被RNase降解。但提取后繼續(xù)處理過(guò)程中應(yīng)使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150 ℃烘烤4h，塑料器皿可在0.5M NaOH中浸泡10min，然后用水徹底清洗，再滅菌，即可去除RNase。 4. 配制溶液應(yīng)使用無(wú)RNase的水（將水加入到干凈的玻璃瓶中，加入DEPC至中濃度0.1%(v/v)，放置過(guò)夜，高壓滅菌。注：DEPC有致癌之嫌，需小心操作）。 不同組織或細(xì)胞RNA提取預(yù)期得率 植物葉片 100-200ug/g葉片 動(dòng)物組織 200-400ug/g肝臟組織 動(dòng)植物培養(yǎng)細(xì)胞 5-10ug/106細(xì)胞 大腸桿菌 2-10ug/mlDH5α過(guò)夜菌 血液 3-5ug/ml人全血 |
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