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DNA提取試劑盒的工作原理及操作步驟
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一、RNA和DNA提取 裂解：裂解公式可能因您要提取 DNA 還是 RNA 而異，但共同點(diǎn)是含有高濃度離液鹽的裂解緩沖液。Chaotropes（離液劑）的作用：Chaotrope會(huì)破壞氫鍵及疏水間的相互作用。離液鹽包括鹽酸胍、硫氰酸胍、尿素和高氯酸鋰。洗滌劑：除了離液劑外，裂解緩沖液中通常還有一些去污劑，以幫助蛋白質(zhì)溶解和裂解。溶菌酶和蛋白酶K:根據(jù)樣品類(lèi)型，也可以使用酶進(jìn)行裂解。蛋白酶 K 就是其中之一，實(shí)際上在這些變性緩沖液中效果較好；當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)變性增多，蛋白酶 K 的作用也會(huì)相應(yīng)增強(qiáng)。然而，溶菌酶在變性中不起作用，因此溶菌酶處理通常在添加變性鹽之前進(jìn)行。 二、關(guān)于質(zhì)粒制備的注意事項(xiàng) 分離質(zhì)粒 DNA 與提取 RNA 或基因組 DNA 的提取方式是不相同的，因?yàn)楸仨氋|(zhì)粒與基因組 DNA 必須分離。如果此刻，您加入離液劑將立即釋放所有物質(zhì)，并且無(wú)法將小環(huán)狀 DNA 與高分子量染色體區(qū)別開(kāi)來(lái)。因此，在質(zhì)粒制備過(guò)程中中，直到裂解后才加入離液劑，鹽用于結(jié)合。 三、DNA 提取后純化：將 DNA 與色譜柱結(jié)合 離液鹽對(duì)于裂解至關(guān)重要，而且對(duì)于將 DNA（或 RNA）與色譜柱結(jié)合也是如此。此外，為了增強(qiáng)和影響核酸與二氧化硅的結(jié)合，還添加了酒精。大多數(shù)情況下這是乙醇，但有時(shí)可能是異丙醇。乙醇百分比和體積有很大的影響。太多，你會(huì)帶入大量降解的核酸和小物種，這會(huì)影響 A260 讀數(shù)并降低你的一些產(chǎn)量。太少，可能難以從膜上洗掉所有鹽分。如果您在裂解中使用含有 SDS 的去污劑，請(qǐng)嘗試使用NaCl 作為沉淀劑，以避免去污劑污染 DNA 或 RNA。 四、洗滌 DNA（或 RNA） 當(dāng)裂解物通過(guò)硅膠膜進(jìn)行離心分離，現(xiàn)在所提取的 DNA 或 RNA 應(yīng)該與柱子結(jié)合，雜質(zhì)、細(xì)胞蛋白和多糖應(yīng)該已經(jīng)通過(guò)了。 但是，膜仍然被殘留的細(xì)胞蛋白質(zhì)和鹽弄臟。如果樣品來(lái)自植物，仍然會(huì)有多糖，也許一些色素留在膜上，或者如果樣品是血液，膜可能會(huì)被染成棕色或黃色。洗滌步驟用于去除這些雜質(zhì)。通常有兩次洗滌，盡管這可能因樣品類(lèi)型而異。第一次洗滌通常會(huì)含有少量的離液鹽，以去除蛋白質(zhì)和有色污染物。這之后總是用乙醇洗滌以除去鹽。如果開(kāi)始的準(zhǔn)備工作沒(méi)有大量蛋白質(zhì)，例如質(zhì)粒準(zhǔn)備或 PCR 清理，則只需要乙醇洗滌。去除離液鹽對(duì)于獲得高產(chǎn)量和高純度的 DNA 或 RNA 至關(guān)重要。一些試劑盒甚至?xí)靡掖记逑粗觾纱�。如果殘留鹽分，核酸的洗脫會(huì)很差，A230讀數(shù)會(huì)很高，導(dǎo)致260/230的比率很低。對(duì)于無(wú)乙醇 DNA 和 RNA，需要進(jìn)行干法離心，乙醇洗滌后，大多數(shù)方案都有一個(gè)離心步驟來(lái)干燥柱子。這是為了去除乙醇，對(duì)于清潔的洗脫液是必不可少的。 當(dāng)將 10 mM Tris 緩沖液或水應(yīng)用于膜進(jìn)行洗脫時(shí)，核酸會(huì)水合并從膜中釋放出來(lái)。如果色譜柱上仍有乙醇，則核酸無(wú)法完全再水合。如果跳過(guò)干燥步驟會(huì)導(dǎo)致乙醇污染和低產(chǎn)量。很可能在 Nanodrop 上看不到乙醇吸光度，所以它不會(huì)出現(xiàn)在您的讀數(shù)中。 五、RNA 和 DNA 提�。合疵� DNA 提取方案的還剩余IDE步驟步就是從硅膠中釋放純 DNA 或 RNA。對(duì)于 DNA 制備，通常使用 pH 值為 8-9 的 10 mM Tris。DNA 在弱堿性 pH 值下更穩(wěn)定，在緩沖液中溶解得更快。即使對(duì)于 DNA 顆粒也是如此。水的 pH 值往往較低，低至 4-5，并且高分子量 DNA 在用于洗脫的短時(shí)間內(nèi)可能無(wú)法完全再水合。通過(guò)在離心前讓緩沖液在膜中停留幾分鐘，可以較大限度地洗脫 DNA。由于RNA 易溶于水，且RNA 利于處在微酸性的 pH 值環(huán)境下。 六、RNA 和 DNA 提取實(shí)驗(yàn)中的問(wèn)題 1.產(chǎn)量低如果您遇到的 DNA/RNA 產(chǎn)量低于您對(duì)樣品的預(yù)期，則需要考慮許多因素。通常，這是一個(gè)裂解問(wèn)題。不完全裂解是產(chǎn)量低的主要原因。它也可能是由不正確的綁定條件引起的。確保使用新鮮的優(yōu)質(zhì)乙醇（100% 200 標(biāo)準(zhǔn)）稀釋緩沖液或添加到結(jié)合的步驟。劣質(zhì)乙醇或舊庫(kù)存可能已經(jīng)吸收了水分，并且濃度不正確。如果洗滌緩沖液制備不正確，您可能正在洗掉提取的 DNA 或 RNA。 2.低純度如果提取的 DNA 被蛋白質(zhì)污染（低 260/280），那么您可能開(kāi)始時(shí)樣品過(guò)多，而蛋白質(zhì)沒(méi)有完全去除或溶解。如果 DNA 的 260/230 比率不佳，則問(wèn)題通常是結(jié)合或洗滌緩沖液中的鹽分。確保使用最高質(zhì)量的乙醇來(lái)制備洗滌緩沖液，如果問(wèn)題仍然存在，請(qǐng)?jiān)俅蜗礈焐V柱。與其他樣品相比，一些樣品含有更多的抑制劑。環(huán)境樣品特別容易出現(xiàn)純度問(wèn)題，因?yàn)楦迟|(zhì)在提取過(guò)程中會(huì)被溶解。腐殖質(zhì)的行為與 DNA 相似，很難從硅膠柱中去除。 3.降解降解問(wèn)題是RNA制備中常常到的問(wèn)題。因?yàn)樵?RNA 提取過(guò)程中，樣品儲(chǔ)存不當(dāng)或裂解效率低等情況都會(huì)導(dǎo)致降解。對(duì)于 DNA 提取，降解不是一個(gè)大問(wèn)題，因?yàn)閷?duì)于 PCR，DNA 可以被剪切并且工作正常，如果不希望有較多剪切的 DNA，可以使用弱裂解的方法。 七、PCR 清理時(shí)的注意事項(xiàng) PCR 凈化其實(shí)并不是 DNA 提取技術(shù)本身，但它是一種效率高且簡(jiǎn)單的技術(shù)，它只是添加高濃度的結(jié)合鹽（通常每體積 PCR 反應(yīng) 3-5 體積鹽）和離心來(lái)過(guò)濾。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，PCR Clean-up 試劑盒出現(xiàn)故障也會(huì)導(dǎo)致整個(gè)實(shí)驗(yàn)功虧一簣。因?yàn)樵赑CR 反應(yīng)中有較多吸收 260 度紫外線的物質(zhì)，比如：核苷酸、去污劑、鹽和引物。所以，PCR 凈化試劑盒經(jīng)常無(wú)法正常工作可能是由于 PCR 反應(yīng)失敗所造一般成較難清理。 公眾號(hào)：畢合生物 畢合生物（www.bihebio.com)提供服務(wù)內(nèi)容：分子生物學(xué)、免疫, 重組蛋白及ELISA相關(guān)、活性小分子化合物、高端化學(xué)、材料化學(xué)、細(xì)胞資源庫(kù)與培養(yǎng)相關(guān)、生命科學(xué)、天然產(chǎn)物 |
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