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鬼筆環(huán)肽—細(xì)胞骨架定位工具
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鬼筆環(huán)肽 — 細(xì)胞骨架定位工具 鬼筆環(huán)肽（phalloidin）是一種強(qiáng)烈毒素，最早是在一種劇毒蘑菇(Amanita phalloides（Vaill ex Fr.）Secr.) （傘菌目，毒傘屬的毒傘）中分離出來，其本身是一種雙環(huán)七肽，肉眼觀察呈無色，細(xì)針狀結(jié)晶。鬼筆環(huán)肽中毒的主要癥狀是由于肝細(xì)胞的破壞引起的急性饑餓。中毒機(jī)制是鬼筆環(huán)肽特異性結(jié)合在細(xì)胞F-肌動蛋白（F-actin）亞基之間的界面，將相鄰的亞基鎖定在一起，防止其解聚并中毒細(xì)胞。 細(xì)胞骨架主要是由微絲，微管和中間絲所組成的，肌動蛋白分成肌動蛋白單體（G-actin）和纖維狀蛋白單體（F-actin），是微絲的主要組成部分，組裝過程可簡單理解為由G-actin結(jié)合變成F-actin。 鬼筆環(huán)肽與F-actin的結(jié)合比與肌動蛋白單體（G-actin）的結(jié)合更緊密，從而導(dǎo)致肌動蛋白亞基從絲端解離的速率常數(shù)減小，防止了絲解聚而基本穩(wěn)定了肌動蛋白絲。根據(jù)這一特性，含鬼筆環(huán)肽的熒光標(biāo)記已廣泛用于顯微技術(shù)中，以在生物醫(yī)學(xué)研究中將F-actin可視化。 1、實驗流程 試劑配制： 1. 儲存液的配制：使用前請用離心機(jī)離心，將離心于管底的凍干粉末按照1T配1μL的比例，溶解在甲醇溶液中，如300T粉末溶解在300μL甲醇中。置于-20°C避光保存； 2. 配制工作液：根據(jù)實驗需求，使用PBS將儲存液按照1:40-1:200稀釋，混勻備用。 固定細(xì)胞染色： 以下描述了貼壁細(xì)胞的染色程序。鬼筆環(huán)肽也可用于染色固定的冷凍或石蠟組織切片，以及酵母和真菌。 1. 用PBS洗滌細(xì)胞3次。 2. 用含有4%甲醛的PBS溶液冰上固定細(xì)胞15分鐘。（注意：甲醇在固定過程中會破壞肌動蛋白。因此，最好避免使用任何含有甲醇的固定劑或其他溶劑型固定劑。優(yōu)選的固定劑是無甲醇甲醛） 3. 用PBS清洗細(xì)胞3次。 4. 在室溫下，用含0.5% Triton X-100的PBS溶液透化細(xì)胞10分鐘。 5. 用PBS清洗細(xì)胞3次。 6. 用200μLPBS稀釋1μL熒光鬼筆環(huán)肽母液，加到每個要染色的爬片或腔室。將染色溶液在室溫下放置20分鐘。（注意：染色量可根據(jù)樣品調(diào)整。為避免蒸發(fā)，請將爬片放在有蓋的容器內(nèi)，并在孵育期間蓋住腔室） 7. 用PBS清洗2-3次。 8. 使用熒光顯微鏡成像。在PBS中熒光鬼筆環(huán)肽具有足夠的光穩(wěn)定性，但為了獲得最佳效果，我們建議使用抗淬滅封片劑。 活細(xì)胞染色： 熒光標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽不具有細(xì)胞通透性，因此尚未廣泛用于活細(xì)胞。然而，鬼筆環(huán)肽仍可通過胞飲或其他機(jī)制標(biāo)記活細(xì)胞。一般來說，活細(xì)胞染色需要大量的染色劑。作為一種選擇，熒光鬼筆環(huán)肽也可被注射到細(xì)胞中，用于監(jiān)測肌動蛋白分布和細(xì)胞運動。 |
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