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細(xì)菌的培養(yǎng)方法及培養(yǎng)基的配置
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一、目的 學(xué)習(xí)細(xì)菌的培養(yǎng)方法及培養(yǎng)基的配置。 二、原理 在基因工程實驗和分子生物學(xué)實驗中，細(xì)菌是不可缺少的實驗材料。質(zhì)粒的保存、增殖和轉(zhuǎn)化；基因文庫的建立等都離不開細(xì)菌。特別是常用的大腸桿菌。 大腸桿菌是含有長約3000kb的環(huán)狀染色體的棒狀細(xì)胞。它能在僅含碳水化合物和提供氮、磷和微量元素的無機(jī)鹽的培養(yǎng)基上快速生長。當(dāng)大腸桿菌在培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，其開始裂殖前，先進(jìn)入一個滯后期。然后進(jìn)入對數(shù)生長期，以20~30min復(fù)制一代的速度增殖。最后，當(dāng)培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分和氧耗盡或當(dāng)培養(yǎng)基中廢物的含量達(dá)到抑制細(xì)菌的快速生長的濃度時，菌體密度就達(dá)到一個比較恒定的值，這一時期叫做細(xì)菌生長的飽和期。此時菌體密度可達(dá)到1×109~2×109/mL。 培養(yǎng)基可以是固體的培養(yǎng)基，也可以是液體培養(yǎng)基。實驗室中zui常用的是LB培養(yǎng)基。 三、實驗材料、試劑與主要儀器 （一） 實驗材料 大腸桿菌 （二） 試劑 1、胰蛋白胨 2、酵母提取物 3、氯化鈉 4、1mol/LNaOH 5、瓊脂粉 6、抗生素（氨芐青霉素、卡那霉素等） （三）儀器 1、培養(yǎng)皿 2、帶帽試管 3、涂布器 4、滅菌鍋 5、無菌操作臺（含酒精燈、接種環(huán)、滅菌牙簽等） 6、恒溫?fù)u床 四、操作步驟 （一）LB培養(yǎng)基的配制 配制每升培養(yǎng)基，應(yīng)在950m1去離子水中加入： 細(xì)菌培養(yǎng)用胰蛋白胨 10g 細(xì)菌培養(yǎng)用酵母提取物 5g NaCl 10g 搖動容器直至溶質(zhì)完全溶解，用1mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH位至7.0。加入去離子水至總體積為lL，在15 lbf／in2 (1.034×105Pa)高壓下蒸氣滅菌20min，即為LB液體培養(yǎng)基。 LB固體培養(yǎng)基是在其液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上另加瓊脂粉15g/L。 （二）細(xì)菌的培養(yǎng) （１）在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng) 1、過夜培養(yǎng) ⑴取5ml液體培養(yǎng)基加入一只無菌的試管中。 ⑵用接種環(huán)或滅菌牙簽挑一個單菌落，接種于培養(yǎng)液中。 ⑶蓋好試管，在搖床上以60r/min速度，于37℃過夜培養(yǎng)。 ２、大體積培養(yǎng) ⑴按1∶100的比例將過夜培養(yǎng)物加入到一無菌燒瓶中，燒瓶的體積應(yīng)該是培養(yǎng)液體積的5倍以上。 ⑵于37℃，約300r/min劇烈搖動培養(yǎng)。 （２）在固體培養(yǎng)基中培養(yǎng) 細(xì)菌在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)主要是為了獲得單菌落和短期保存。 平板劃線法分離單菌落 ⑴采用無菌技術(shù)，用接種環(huán)將接種物從平板的一側(cè)開始劃線。 ⑵重新消毒接種環(huán)，從一劃線處將樣品劃線至平板的其余部分，重復(fù)劃線直至覆蓋整個平板。 ⑶于37℃培養(yǎng)直至長出單菌落。 公眾號：畢合生物 畢合生物（www.bihebio.com)提供服務(wù)內(nèi)容：分子生物學(xué)、免疫, 重組蛋白及ELISA相關(guān)、活性小分子化合物、高端化學(xué)、材料化學(xué)、細(xì)胞資源庫與培養(yǎng)相關(guān)、生命科學(xué)、天然產(chǎn)物 |
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