 |
 |
 |
 |
 |
 |
||
 |
 |
 |
 |
 |
| 1 | 1/1 | 返回列表 |
| 查看: 505 | 回復: 0 | |||
科研小努力新蟲 (小有名氣)
|
[交流]
實驗技巧 | 7種較常見的流式疑難問題解析
|
|
1. 無信號/熒光強度弱 信號補償不正確 檢查流式細胞儀上單色陽性對照是否設(shè)置正確，以及門控和補償設(shè)置是否正確，確保您能捕獲所有事件。 用于檢測的抗體不足 增加抗體量或抗體濃度。 無法接近細胞內(nèi)靶標 檢查靶蛋白是否是位于細胞內(nèi)，或者膜蛋白的抗體表位是否位于細胞內(nèi)。關(guān)于細胞內(nèi)染色，確保充分透化。為防止細胞表面蛋白質(zhì)發(fā)生內(nèi)化，所有操作步驟必須在冰上或 4℃ 下用預(yù)冷的交聯(lián)試劑完成，以阻止所有細胞反應(yīng)。 在實驗試劑中添加疊氮化鈉可阻止表面抗原的調(diào)變和內(nèi)化，但會導致熒光強度損失。對于粘附細胞系的染色，胰蛋白酶通�？梢哉T使細胞表面蛋白發(fā)生內(nèi)化，并且可能需要更溫和的分離方法。 細胞內(nèi)染色 - 熒光染料結(jié)合分子太大 細胞內(nèi)染色實驗應(yīng)使用小分子量的熒光染料。分子量大的熒光染料會降低抗體活性，阻止抗體進入細胞標記目標蛋白。 激光器未對齊 確保流式細胞儀上的激光器正確對齊，必要時通過運行液流檢查微珠來調(diào)整路線。如果激光器未正確對齊或發(fā)生偏移，則可能需要考慮維修機器。 靶蛋白不存在/低水平表達 確保您正在分析的組織/細胞類型能表達靶蛋白，并且靶蛋白的量足以被檢出。 可溶性/分泌性靶蛋白 靶蛋白是否可溶并由細胞分泌？靶蛋白需要嵌合在細胞膜上或存在于細胞質(zhì)里，以便輕松通過流式細胞術(shù)檢出。通過高爾基體封閉步驟，例如加入 Brefeldin A，可以改善細胞內(nèi)的染色信號。 補償過高/增益過低 使用陽性對照正確設(shè)置流式細胞儀，利用補償確保細胞的熒光信號不被切斷，提高增益以增強信號（在合理范圍內(nèi) - 應(yīng)謹慎操作）。 熒光染料的熒光消退 抗體可能存放太久或沒有避光。需要新鮮抗體。 一抗和二抗不匹配 使用的二抗應(yīng)與一抗來源種屬不同（例如，一抗為兔源，則應(yīng)該使用抗兔源二抗）。為了解決種屬交叉反應(yīng)性的問題，您可以使用經(jīng)流式細胞術(shù)驗證的直接偶聯(lián)一抗，或者使用偶聯(lián)物試劑盒，在您選擇的抗體中加入合適的熒光染料。 2. 熒光強度高 抗體濃度過高 會導致強非特異性結(jié)合或高熒光強度。減少每個樣本中添加的抗體量。 過量抗體被捕獲 可能是胞內(nèi)染色特有的問題，這種情況下，抗體上的大熒光染料分子可能被捕獲在細胞內(nèi)。確保洗滌步驟充分，并在洗滌緩沖液中加入吐溫或Triton，以保持細胞的透化作用。 封閉不足 在您的抗體混合液中加入1%-3%封閉劑，并增加封閉步驟。 3. 背景高/陽性細胞百分比高 增益設(shè)置過高/補償過低 使用陽性對照正確設(shè)置流式細胞儀，使用補償減少小顆粒背景信號并減少增益，以降低信號。 抗體過量 降低抗體濃度。還可以在洗滌緩沖液中添加去污劑，確保洗去過量的抗體。 4. 在應(yīng)該只有一個細胞群的情況下觀察到兩個或多個細胞群 表達靶蛋白的細胞群不止一個 檢查樣本包含的細胞類型的預(yù)期蛋白表達水平，如有必要，確保細胞充分分離。 出現(xiàn)細胞雙峰 細胞雙峰顯示為第二大細胞群，其熒光強度大約是單細胞熒光強度的兩倍。染色前用移液槍將細胞輕柔混勻，放入細胞儀中運行前再次混勻。也可以篩選或過濾細胞，以去除團塊（30μL尼龍網(wǎng)）。 5. 側(cè)向散射背景偏高（來自小顆粒） 細胞裂解 確保樣本中的細胞沒有裂解和破碎。樣本應(yīng)新鮮，并正確制備。不要在高轉(zhuǎn)速的情況下對細胞進行離心或激烈渦旋。 細菌污染 確保樣本不受污染。細菌會自動發(fā)出較弱的熒光，導致高事件率。 6. 低事件率 每毫升的細胞數(shù)過少 運行1×106個細胞/mL。確保細胞混合均勻（輕柔混勻）。 細胞聚集，阻塞管道 染色前輕輕吹打幾次，確保得到同源單細胞懸液。確保上機前再次混勻。極端情況下，可以篩選或過濾細胞，以去除團塊（300目尼龍網(wǎng)）。 7. 高事件率 細胞數(shù)量過多 稀釋至1×105至1×106個細胞/mL。 |
回復此樓» 猜你喜歡
一志愿北京化工大學材料與化工296分求調(diào)劑
已經(jīng)有17人回復
-
0703化學一志愿211 總分320求調(diào)劑
已經(jīng)有3人回復
-
0703求調(diào)劑
已經(jīng)有6人回復
-
（081700）化學工程與技術(shù)-298分求調(diào)劑
已經(jīng)有6人回復
-
一志愿天津大學材料與化工275求調(diào)劑
已經(jīng)有22人回復
-
0857 資源與環(huán)境 285分
已經(jīng)有6人回復
-
材料工程,326分，求調(diào)劑
已經(jīng)有5人回復
-
301求調(diào)劑
已經(jīng)有5人回復
-
334求調(diào)劑
已經(jīng)有3人回復
-
材料與化工085600調(diào)劑求老師收留
已經(jīng)有5人回復
» 本主題相關(guān)商家推薦: (我也要在這里推廣)
相關(guān)版塊跳轉(zhuǎn)
我要訂閱樓主 科研小努力 的主題更新
| 1 | 1/1 | 返回列表 |
| 最具人氣熱帖推薦 [查看全部] | 作者 | 回/看 | 最后發(fā)表 | |
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 材料工程專碩，一志愿中國礦業(yè)大學，總分314，求調(diào)劑 +4 | 無懈可擊的巨人 2026-03-10 | 4/200 |
|
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 308求調(diào)劑 +4 | 是Lupa啊 2026-03-08 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 環(huán)境調(diào)劑 +5 | 曉看天暮看云 2026-03-09 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 085600材料與化工，一志愿廣州985，求調(diào)劑 +15 | qqyyaill 2026-03-05 | 15/750 |
|
|
|
[基金申請] 面上項目還需要AI說明嗎？ +3 | liyundong 2026-03-08 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 0703求調(diào)劑 +10 | c297914 2026-03-06 | 11/550 |
|
|
|
[考研] 334求調(diào)劑 +5 | Trying] 2026-03-07 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 考研調(diào)劑，一志愿山東大學材料與化工，328分，政治51 +5 | 關(guān)你西紅柿929 2026-03-08 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 0856求調(diào)劑 +3 | squirtle11 2026-03-07 | 3/150 |
|
|
|
[教師之家] 交大前校長王樹國：現(xiàn)在最先進的科技并不在大學實驗室，而是在企業(yè)研究院 +4 | zju2000 2026-03-08 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 求調(diào)劑，一志愿華中科大0702，數(shù)一英一，293 +4 | 小羅露一二 2026-03-07 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 0817化學工程與技術(shù)312分求調(diào)劑 +7 | T123 tt 2026-03-04 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 材料調(diào)劑 +7 | ounce. 2026-03-05 | 15/750 |
|
|
|
[考研] 材料科學（0805）338 求調(diào)劑 +7 | xiaokang3286 2026-03-07 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 322分 085600求調(diào)劑，有互聯(lián)網(wǎng)+國金及主持省級大創(chuàng)經(jīng)歷 +4 | 熊境喆 2026-03-05 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 070300化學求調(diào)劑292分 +3 | 打烊eee 2026-03-07 | 3/150 |
|
|
|
[考研]
 085600材料與化工 292分 求調(diào)劑
+6
|
程晴之 2026-03-06 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 316求調(diào)劑 +3 | 林小星發(fā)大財 2026-03-05 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 材料調(diào)劑 +5 | ws 上岸鴨 2026-03-05 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 復試調(diào)劑 +5 | 呼呼？~+123456 2026-03-05 | 5/250 |
|