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科研小努力新蟲 (小有名氣)
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細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)
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細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)原理：細(xì)胞黏附性是維持組織結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的基本條件，也是細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和發(fā)揮功能的調(diào)節(jié)因素，并且對(duì)細(xì)胞的增殖、分化有重要影響。通常可分為兩類，即細(xì)胞與細(xì)胞黏附和細(xì)胞與基質(zhì)黏附。 機(jī)體內(nèi)許多細(xì)胞，如上皮細(xì)胞，需要牢固地定在某處發(fā)揮功能；另一些細(xì)胞，如白細(xì)胞，活躍運(yùn)動(dòng)，就需要不斷調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附。細(xì)胞黏附性的改變?cè)谀[瘤轉(zhuǎn)移過程中也發(fā)揮著重要作用。惡性腫瘤具有從原發(fā)瘤分離及在體內(nèi)擴(kuò)散的能力，提示這些細(xì)胞在相互識(shí)別及黏附機(jī)制方面發(fā)生了改變。 實(shí)驗(yàn)方法： 1、將4.5×105個(gè)Hep3B細(xì)胞/孔傳代于無(wú)菌6孔培養(yǎng)板中。 2、培養(yǎng)24h后，用Lipofectamine TM 2000將37LRP siRNA轉(zhuǎn)染Hep3B細(xì)胞（兩個(gè)平行孔，Lipofectamine TM 2000轉(zhuǎn)染具體操作見方法7），轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞置37℃、5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，48h后收集細(xì)胞。同時(shí)各有兩個(gè)平行孔的細(xì)胞進(jìn)行陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染及不行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染終濃度即siRNA終濃度為100nmol/L。 3、培養(yǎng)48小時(shí)后收集細(xì)胞，用0.25%胰酶將貼壁培養(yǎng)細(xì)胞（約1×106個(gè)）從壁上消化下來(lái)并制成單細(xì)胞懸液。 4、用無(wú)血清MEM培養(yǎng)基將Matrigel配制成10ug/250ul（1:300）的人工基底膜膠備用。 5、96孔板每孔中鋪Matrigel 2ug/50ul，放于超凈臺(tái)中風(fēng)干過夜。 6、96孔板每孔加入適量無(wú)血清MEM細(xì)胞培養(yǎng)液(或PBS或生理鹽水)，放置60－90分鐘，洗去多余的膠； 7、取轉(zhuǎn)染、陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染及不行轉(zhuǎn)染的Hep3B細(xì)胞以4×103/孔接種在鋪膠的96孔板中，設(shè)3個(gè)重復(fù)孔，放入37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)20min、40min、60min。 8、在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)取出96孔板，吸出培養(yǎng)液，用PBS洗3遍，洗去未粘附細(xì)胞。 9、每孔加入100 ul甲醇，固定15min。 10、每孔加入100 ul姬姆薩染液，染色15min，蒸餾水洗去染液。 11、在200倍顯微鏡下計(jì)數(shù)粘附細(xì)胞數(shù)量（每孔在固定位置取8個(gè)視野）。 |
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