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細胞破碎技術(shù)
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細胞破碎技術(shù)是指利用外力破壞細胞膜和細胞壁，使細胞內(nèi)容物包括目的產(chǎn)物成分釋放出來的技術(shù)，是分離純化細胞內(nèi)合成的非分泌型生化物質(zhì)（產(chǎn)品）的基礎(chǔ)。 結(jié)合重組DNA技術(shù)和組織培養(yǎng)技術(shù)上的重大進展，以前認為很難獲得的蛋白質(zhì)現(xiàn)在可以大規(guī)模生產(chǎn)。 細胞破碎技術(shù) 目前已發(fā)展了多種細胞破碎方法，以便適應(yīng)不同用途和不同類型的細胞壁破碎。 破碎方法可規(guī)納為機械法和非機械法兩大類。 機械法 高壓勻漿破碎法（homogenization） 高壓勻漿器是常用的設(shè)備，它由可產(chǎn)生高壓的正向排代泵（positive displacenemt pump）和排出閥（discharge valve）組成，排出閥具有狹窄的小孔，其大小可以調(diào)節(jié)。細胞漿液通過止逆閥進入泵體內(nèi)，在高壓下迫使其在排出閥的小孔中高速沖出，并射向撞擊環(huán)上，由于突然減壓和高速沖擊，使細胞受到高的液相剪切力而破碎。在操作方式上，可以采用單次通過勻漿器或多次循環(huán)通過等方式，也可連續(xù)操作。為了控制溫度的升高，可在進口處用干冰調(diào)節(jié)溫度，使出口溫度調(diào)節(jié)在20℃左右。在工業(yè)規(guī)模的細胞破碎中，對于酵母等難破碎的及濃度高或處于生長靜止期的細胞，常采用多次循環(huán)的操作方法。 ～振蕩珠擊破碎法 (Skaking Bead) 將等體積的小量組織樣品與高密度的ZircoBeads放入可密封的2ml螺旋蓋微量管中,再加入緩沖液與穩(wěn)定成份到1.5ml的體積, 用6500RPM振蕩機高速上下振動8秒,休息8秒,再振動8秒即可.此方法是目前最快且一次可處理最多樣品的方法. 一臺機器最多可以在一天處理2400支樣品.對小量且多樣的人很方便. ～高速攪拌珠研磨破碎法（fine grinding） 研磨是常用的一種方法，它將細胞懸浮液與玻璃小珠、石英砂或氧化鋁等研磨劑一起快速攪拌，使細胞獲得破碎。在工業(yè)規(guī)模的破碎中，常采用高速珠磨機 。 ～超聲波破碎法（ultrasonication） 超聲波破碎法利用超聲波振蕩器發(fā)射的15-25kHz的超聲波探頭處理細胞懸浮液。 超聲波振蕩器有不同的類型，常用的為電聲型，它是由發(fā)生器和換能器組成，發(fā)生器能產(chǎn)生高頻電流，換能器的作用是把電磁振蕩轉(zhuǎn)換成機械振動。超聲波振蕩器以可分為槽式和探頭直接插入介質(zhì)兩種型式，一般破碎效果后者比前者好。 非機械法 ～滲透壓沖擊破碎法（osmotic shock） 滲透壓沖擊是較溫和的一種破碎方法，將細胞放在高滲透壓的溶液中（如一定濃度的甘油或蔗糖溶液），由于滲透壓的作用，細胞內(nèi)水分便向外滲出，細胞發(fā)生收縮，當達到平衡后，將介質(zhì)快速稀釋，或?qū)⒓毎D(zhuǎn)入水或緩沖液中，由于滲透壓的突然變化，胞外的水迅速滲入胞內(nèi)，引起細胞快速膨脹而破裂。 ～凍融破碎法（freezing and thawing） 將細胞放在低溫下冷凍（約-15℃），然后在室溫中融化，反復(fù)多次而達到破壁作用。由于冷凍，一方面能使細胞膜的疏水鍵結(jié)構(gòu)破裂，從而增加細胞的親水性能，另一方面胞內(nèi)水結(jié)晶，形成冰晶粒，引起細胞膨脹而破裂。對于細胞壁較脆弱的菌體，可采用此法。 ～酶溶破碎法（enzyme lysis） 酶解是利用溶解細胞壁的酶處理菌體細胞，使細胞壁受到部分或完全破壞后，再利用滲透壓沖擊等方法破壞細胞膜，進一步增大胞內(nèi)產(chǎn)物的通透性。溶菌酶（lysozyme)適用于革蘭氏陰性菌細胞的分解，應(yīng)用于革蘭氏陽性菌時，需輔以EDTA使之更有效地作用于細胞壁。 真核細胞的細胞壁不同于原核細胞，需采用不同的酶。 ～化學(xué)破碎法（chemical treatment） 采用化學(xué)法處理可以溶解細胞或抽提胞內(nèi)組分。常用酸、堿、表面活性劑和有機溶劑等化學(xué)試劑 ～去垢劑破碎法（detergents） 蛋白質(zhì)復(fù)性 利用包含體與細胞碎片的密度差，用離心法將包含體與細胞碎片和可溶性蛋白質(zhì)分開，獲得了干凈的包含體，再對包含體溶解復(fù)性。這樣首先就擺脫了大量的雜蛋白、核酸、熱原、內(nèi)毒素等雜質(zhì)，使后面的分離純化簡單了。從這個角度上講，包含體的形成對分離純化亦有好處。 作者：畢合生物 公眾號：畢合生物 畢合生物（www.bihebio.com)提供服務(wù)內(nèi)容：分子生物學(xué)、免疫, 重組蛋白及ELISA相關(guān)、活性小分子化合物、高端化學(xué)、材料化學(xué)、細胞資源庫與培養(yǎng)相關(guān)、生命科學(xué)、天然產(chǎn)物 |
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