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科研小努力新蟲 (小有名氣)
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[交流]
腫瘤細胞侵襲實驗步驟
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實驗方法 1、復蘇代數(shù)靠前的腫瘤細胞，在含有10% FBS的培養(yǎng)基中預先培養(yǎng)2-3代，待細胞匯合達到80%左右，饑餓處理18-24小時。 2、準備鋪膠： a）4 °C溶matirgel膠過夜 b）將細胞小室、培養(yǎng)板和槍頭等于4°C 預冷 c）用無血清的冷培養(yǎng)基稀釋matirgel膠至一定濃度，加入到細胞小室的上層（按照產(chǎn)品說明書的推薦比例和體積），輕輕搖晃使膠均勻鋪在膜上。以上操作在冰上進行 d）立即將鋪好matrigel膠的細胞小室置于培養(yǎng)板中，于37°C孵育1小時左右，matirgel膠可由液體凝成固體，吸走多余的或者未凝的膠 3、細胞用PBS清洗一次，胰酶消化，然后用包含5% BSA的無血清培養(yǎng)基中和，1500rpm離心5-10min。 4、用無血清培養(yǎng)基重懸細胞，調(diào)整細胞密度 5、取上述細胞液加入小室，下室（培養(yǎng)板）加入含有10% FBS的培養(yǎng)基。不同規(guī)格的小室和培養(yǎng)板所加的體積不同，具體參考產(chǎn)品說明書 6、37 °C孵育24至72小時，依據(jù)腫瘤細胞類型而定 7、孵育結(jié)束，小心取出細胞小室，吸掉小室上層培養(yǎng)液，PBS清洗一遍，70%酒精或者4%多聚甲醛固定5min，0.5%結(jié)晶紫（2%乙醇或PBS溶解）染色20min，然后進行第8步或者第9步。 8、PBS清洗兩次以去除多余的染料，立即用棉簽擦去濾膜上層的細胞，自然靜置風干。顯微鏡下觀察濾膜下層的細胞，隨機選取不同的視野計數(shù)并算平均值。 9、結(jié)晶紫溶解濾膜下層細胞，然后用33%醋酸脫色，將結(jié)晶紫完全洗脫下來，洗脫液可在酶標儀上570nm讀取OD值。這種方法可以避免視野下細胞穿透不均勻帶來的誤差。 10、計數(shù)：Transwell侵襲實驗結(jié)果統(tǒng)計分析有兩種方法 直接計數(shù)法：通過給細胞染色，直接在鏡下計數(shù)。選擇不同的視野拍照（一般選擇呈現(xiàn)視野中穿過的細胞），計數(shù)的結(jié)果可做成統(tǒng)計圖，輔助呈現(xiàn)數(shù)據(jù)。 間接計數(shù)法：主要用于穿過細胞過多，而無法通過計數(shù)獲得準確的細胞數(shù)所采用的方法，與常用的MTT實驗是同樣的原理。它包括：MTT法、 熒光試劑檢測、 結(jié)晶紫檢測。 |
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