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細胞實驗 | CCK-8實驗錦囊非你莫屬
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一、原理： Cell Counting Kit-8（簡稱CCK-8）試劑含有WST-8，它在電子載體（1-Methoxy PMS）的作用下被細胞線粒體中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物（Formazan dye）。生成的甲瓚物的數(shù)量與活細胞的數(shù)量成正比，因此可利用這一特性直接進行細胞增殖和毒性分析。 CCK-8法因其高靈敏度，無放射性的比色檢測法的優(yōu)點，可替代傳統(tǒng)的MTT法。 二、檢測步驟： 向96孔的各孔中加入100μl細胞懸液。 使用適當?shù)呐囵B(yǎng)基制備50,000-100,000個/ml的細胞懸液。 在37℃下預孵育培養(yǎng)板。 向各孔中加入各濃度的待測溶液（使用培養(yǎng)基或PBS來制備溶液）10μl。 37℃下孵育。 向各孔中加入10μl的CCK-8溶液。如果待測溶液有還原性，測定不含細胞，但含有CCK-8的待測溶液在450 nm處的空白吸光度。如果該吸光度很小，則可以直接加入CCK-8，如果吸光度相對較大，則需要除去培養(yǎng)基，并用培養(yǎng)基洗滌細胞兩次，然后加入新的100μl培養(yǎng)基和10μl的CCK-8 進行檢測。 37℃下孵育1-4小時。白細胞可能需要培養(yǎng)較長時間。 測定450 nm處的OD值。 活力計算 細胞活力*（%）=【A（加藥）-A（空白）】/【A（0加藥）-A（空白）】×100 A（加藥）：具有細胞、CCK-8溶液和藥物溶液的孔的吸光度 A（空白）：具有培養(yǎng)基和CCK-8溶液而沒有細胞的孔的吸光度 A（0加藥）：具有細胞、CCK-8溶液而沒有藥物溶液的孔的吸光度 *細胞活力：細胞增殖活力或細胞毒性活力 三、存在的各種疑問： 1. 一個孔中應接種多少個細胞？ 當使用標準96孔板時，貼壁細胞的最小接種量至少為1,000個/孔（100μl培養(yǎng)基）。檢測白細胞時的靈敏度相對較低，因此推薦接種量不低于2,500個/孔（100μl培養(yǎng)基）. 如果要使用24孔板或6孔板實驗，請先計算每孔相應的接種量，并按照每孔培養(yǎng)基總體積的10%加入CCK-8溶液。 2. 能否用384孔板進行試驗？ 可以。向各孔中加入培養(yǎng)基體積10%的CCK-8溶液，如果加入的CCK-8體積太少，可以先將CCK-8溶液稀釋1倍，然后加入培養(yǎng)基體積20%的量。 3. 酚紅會影響檢測嗎？ 不會。培養(yǎng)基中酚紅的吸光度可以在計算時，通過扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不會對檢測造成影響。 4. CCK-8與胸苷結(jié)合檢測之間是否有 相關(guān)性》 有。然而，請注意由于CCK-8使用的檢測原理與胸苷檢測的不同，因此結(jié)果可能不同。 5. CCK-8能否檢測細菌細胞？ 可以檢測E.coli，但不能檢測酵母細胞。向100μl E.coli培養(yǎng)液中加入10μl CCK-8溶液，并培養(yǎng)1-4個小時或過夜。 6. CCK-8穩(wěn)定嗎？ CCK-8在0-5℃下能夠保存至少6個月，在-20℃下避光可以保存1年。如果需要長期保存，我們推薦-20℃的儲藏條件。 7. CCK8能否對活細胞進行染色？ 不能。因為 CCK8 的主要成分是一種水溶性的四唑鹽（WST8），并通過電子載體1-Methoxy PMS將活細胞中的電子交換到培養(yǎng)基中的WST8上。由于生成的物質(zhì)也是高度水溶性的，因此CCK8不能對細胞進行染色。 8. CCK8檢測溶液對細胞是否有毒？ CCK8溶液自身因為高濃度的1-Methoxy PMS的存在而具有一點毒性。但是，加到培養(yǎng)基中的CCK8是沒有毒性的，因為被稀釋了10倍。因此，長時間的培養(yǎng)，如過夜或者培養(yǎng)數(shù)天是可以的。同一個細胞培養(yǎng)液在CCK8檢測后還可以用于其他細胞增殖檢測，如結(jié)晶紫檢測，中性紅檢測或者DNA熒光檢測等。由于每種細胞對于CCK8的耐受力都不同，因此在需要進行長時間培養(yǎng)時，先檢測一下細胞在加入CCK8培養(yǎng)后的活力。 9. 在做加藥實驗時，藥物對測定是否 有影響？如何解決？ 有時會有影響。如果藥物具有還原性，會和CCK8發(fā)生顯色反應，增加吸光度。解決辦法：首先要確認藥物是否有吸收，在含有藥物的培養(yǎng)基中加入CCK8，測定450 nm的吸光度，如果它的吸光度比不含藥物的培養(yǎng)基（加CCK8）的吸光度高，則證明藥物有影響，可在加CCK8之前更換培養(yǎng)基，去掉藥物的影響。 10. 每次測定的數(shù)值不一樣，是什么原因？ 如何解決？ 可能會有以下幾個原因：1.當在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)時，培養(yǎng)板最外一圈的孔最容易干燥揮發(fā)，由于體積不準確而增加誤差。一般情況下，最外一圈的孔只加培養(yǎng)基，不作為測定孔用。2.有可能會因為CCK8沾在壁上而產(chǎn)生誤差，建議在加入CCK8后，輕輕敲擊培養(yǎng)板以幫助混勻。3.每孔的細胞數(shù)量過多或過少。請預先摸索條件。 12. 如何設(shè)定空白對照？ 在不含細胞的培養(yǎng)基中加入CCK8，培養(yǎng)一定的時間，測定450 nm的吸光度即為空白對照。在做加藥實驗（細胞毒性實驗）時，還應考慮藥物的吸收，可在不含細胞，加入藥物的培養(yǎng)基中加入CCK8，培養(yǎng)一定的時間，測定450nm的吸光度作為空白對照。 13. 哪些物質(zhì)會影響CCK8的測定？ 當有還原性物質(zhì)存在時會影響CCK8的測定，例如含有維生素C的Glucose等（一般培養(yǎng)基中的量不多，酚紅或血清不影響測定）。在有酚紅存在的情況下，會增加空白吸收，但不影響測定，扣除空白吸收即可。 14. 設(shè)定參比波長的目的是什么？ 必須設(shè)定嗎？ 不一定要設(shè)定。CCK-8試劑在參比波長沒有吸光度。設(shè)定參比波長的目的是為了取出由于樣品混濁所帶來的吸收。 15. 在CCK-8顯色過程中，如何終止反應？ 有一下幾種方法（96孔板）：1、在顯色反應后，將培養(yǎng)板放置4℃冰箱內(nèi)。2、每孔加10μl 0.1 M HCL溶液。3、每孔加10μl 1%（w/v）的SDS（十二烷基硫酸鈉）溶液。注意：反應停止后，應在24小時之內(nèi)測定。 16. 必須預培養(yǎng)細胞嗎？ 不一定。如果要向保持細胞的最好狀態(tài)，建議預培養(yǎng)細胞。如果不做細胞預培養(yǎng)，細胞內(nèi)的脫氫酶可能會不穩(wěn)定。也有人不做細胞預培養(yǎng)，但在做標準曲線和檢測時需要統(tǒng)一檢測條件。 17. CCK-8試劑的保存條件？ 在避光條件下CCK-8試劑在 4℃可保存一年。如果需要保存較長時間的話，推薦在-20℃下保存。但是CCK-8若反復解凍和冰凍將會增加空白吸收，從而影響檢測結(jié)果，若經(jīng)常使用可將試劑存放在4℃冰箱內(nèi)保存。 18. 預培養(yǎng)后，更換培養(yǎng)基需要細胞 計數(shù)嗎？ 一般情況下用胰蛋白酶處理對數(shù)增長期的細胞，用血球計數(shù)盤計數(shù)，制備成一定濃度的細胞懸液即可。如果想要精密計數(shù)細胞的話，可以預培養(yǎng)后取培養(yǎng)基用血球計數(shù)盤進行計數(shù)。 19. CCK-8對于不同的細胞，靈敏度是否 一樣？ 不一樣，懸浮細胞與貼壁細胞相比較難染色。對于貼壁細胞，一般加入CCK-8培養(yǎng)1-4小時吸光度已經(jīng)很高，但對于懸浮細胞則可能吸光度較低，可以通過延長CCK-8的加入時間或增加細胞數(shù)量來解決。 20. 懸浮細胞和貼壁細胞在數(shù)量上 有何區(qū)別？ 懸浮細胞由于染色比較困難，一般需要增加細胞數(shù)量和延長培養(yǎng)時間。貼壁細胞染色比較容易，若細胞數(shù)量過大，有時吸光度會超過酶標儀的讀數(shù)。 21. 應該每次做標準曲線嗎？ 建議每次做。雖然細胞是一樣的，但是細胞的狀態(tài)不一定一樣，對于狀態(tài)不一樣的細胞，建議每次做標準曲線。如果試劑的批號不一樣，靈敏度可能會有輕微的差異，對于不同的批號建議分別做標準曲線。 |
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